论文部分内容阅读
生物质乙醇是满足人类能源需求、缓解能源危机的重要可再生能源之一。实现生物质乙醇生产的关键技术问题,主要包括生物质的高效水解及水解糖的高效利用、乙醇发酵新菌种的选育和发酵工艺技术的创建与应用。为此,本论文选取大肠杆菌为主要研究对象,以获得优良产乙醇菌株为目的,并以此为基础探索生物质乙醇发酵新工艺与新技术,以期改善生物质乙醇的生产效率与经济可行性,获得了如下主要研究结果:1)阻断大肠杆菌主要有机酸副产物合成途径,显著提高了其代谢葡萄糖合成乙醇的得率。在删除了甲酸、乙酸和乳酸合成途径的基础上,构建了乙醇生产菌Escherichia coli B0013-1030PA;在摇瓶发酵水平上,此菌株能够代谢25 g·L-1葡萄糖产生11.25 g·L-1乙醇,乙醇得率为理论得率的86.0%,较对照提高了15.7%;此菌株在乙醇发酵的同时,合成并积累2.37 g·L-1琥珀酸,0.18 g·L-1乙酸,乳酸和甲酸未被检出。进一步删除其琥珀酸合成途径关键酶基因frdA,获得菌株E.coli B0013-1031PA;在摇瓶发酵水平上,此菌株能够代谢25 g·L-1葡萄糖产生11.90 g·L-1乙醇,达到理论得率的93.0%,仅合成与积累0.12 g·L-1琥珀酸。2)解析了E.coli B0013利用木糖生长缓慢的遗传本质,进而通过同源重组修复了其木糖代谢。以木糖为唯一碳源,E.coli B0013的比生长速率为0.17 h-1,仅为对照菌株E.coli K12比生长速率(0.35 h-1)的48.6%;在E.coli B0013中表达E.coli K12木糖运输操纵子xylFGH后,菌株利用木糖的比生长速率恢复到0.32 h-1;克隆E.coli B0013的xylFGH并进行序列测定与分析,xylH的第126位密码子突变为终止密码子TAG,引起xylH的读框提前终止;通过分子克隆与同源重组,将E.coli K12的xyl H部分片段（117 bp-462 bp）转入E.coli B0013,筛选获得了xylH回复突变株E.coli B0013H,其xylH的第126位密码子由TAG回复突变为TGG,此菌株利用木糖的比生长速率为0.33 h-1,接近E.coli K12。可见,E.coli B0013的xylH发生无义突变,使其丧失了木糖主要运输功能,木糖代谢变缓;回复突变xylH后恢复了其木糖快速利用能力。3)研究了大肠杆菌代谢葡萄糖与木糖的不协调性,分别构建了选择性代谢葡萄糖或木糖的产乙醇大肠杆菌菌株,探索了运用两种糖选择性代谢菌株进行混合培养与发酵的代谢特征。以葡萄糖和木糖为混合碳源时,大肠杆菌E.coli B0013-1031HPA木糖代谢慢于葡萄糖;通过基因删除技术,分别构建了不代谢葡萄糖的E.coli B0013-2011H菌株和不代谢木糖的E.coli B0013-2010菌株,以此为基础,构建了乙醇合成菌株E.coli B0013-2010PA和E.coli B0013-2011HPA;在两菌株的共同参与下,厌氧阶段发酵25 g·L-1葡萄糖和25 g·L-1木糖,生成了24.2 g·L-1乙醇,乙醇的合成速率为1.01 g·L-1·h-1,葡萄糖消耗速率为2.02 g·L-1·h-1,木糖消耗速率达到1.05 g·L-1·h-1,木糖/葡萄糖消耗速率比为0.52:1,是对照（0.37:1）的1.4倍。通过两种菌株的混合培养与发酵,显著改善了乙醇发酵过程中木糖和葡萄糖代谢的同步性。4)构建了葡萄糖代谢可控菌株,研究了其代谢混合糖为乙醇的技术可行性。在不代谢葡萄糖菌株B0013-2020H的基础上,构建了受温度诱导型λPR-PL启动子调控的ptsG表达盒,将其整合到E.coli B0013-2020H的frdA位点,同步删除frdA,获得了菌株E.coli B0013-2021H。此菌种在34oC生长温度下,能够代谢所测试的木糖、半乳糖和阿拉伯糖,但不代谢葡萄糖;在37oC和42oC的诱导培养温度下,其葡萄糖代谢能力恢复。以此为基础构建了产乙醇菌株B0013-2021HPA并在7 L发酵罐中进行混合糖乙醇发酵,采用34oC下好氧菌体培养和42oC下厌氧乙醇发酵的“双阶段双温控”发酵工艺,合成40.6g·L-1乙醇,乙醇合成速率为2.03 g·L-1·h-1,较对照菌株E.coli B0013-1031HPA【1.66g·L-1·h-1】提高了22.3%,耗糖速率为5.90 g·L-1·h-1,较对照菌株【4.74 g·L-1·h-1】提高了24.5%。所构建的葡萄糖利用可控菌株,可代谢除葡萄糖外的其他单糖进行细胞增殖,在乙醇发酵阶段则可代谢以葡萄糖为主的全部单糖合成乙醇,显著提高了混合糖发酵过程中乙醇的合成效率。5)构建并运用木糖运输和代谢缺陷的大肠杆菌菌株,研究了发酵混合糖为乙醇的同时回收木糖,探索了木糖-乙醇联产新工艺。进一步删除E.coli B0013-2010的xylE,完全阻断木糖运输途径,构建了不利用木糖菌株E.coli B0013-2012,此菌株不再代谢木糖,但其葡萄糖、半乳糖或阿拉伯糖代谢不受影响。进一步构建获得产乙醇菌株E.coli B0013-2012PA,在7 L发酵罐中,此菌株发酵混合糖中的葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖,生成了53.4 g·L-1乙醇;混合糖中的木糖未被代谢而积累于发酵液中,木糖回收率为98.6%。