第一部分人精浆中主要来自睾丸和附睾的miRNAs鉴定背景与目的：学者们一直期待能开发男性不育表观遗传标记物,目前主要通过睾丸和附睾组织获取与精子发生和成熟相关的表观遗传信息,对睾丸和附睾组织依赖限制了其在人的研究。近来,在人精浆中发现大量niRNA (cell-free seminal miRNA, cfs-miRNA),近期研究提示可作为男性不育无创诊断的潜在标记物。睾丸和附睾是精子发生和成熟的主要器官,主要来自于睾丸和附睾的精液miRNAs能可靠反映这些器官的表达谱,有望为男性不育提供可靠的表观遗传无创性标记物。为此,我们鉴定了人cfs-miRNA中主要来自于睾丸和附睾的miRNAs。方法：由于成功输精管切除的射出精液中不含有任何睾丸和附睾分泌物,通过Solexa测序比较5例输精管切除混合cfs-miRNA和4例精液参数正常混合cfs-miRNA中：miRNAs谱含量,筛选出主要来自睾丸和附睾的miRNAs。分别提取3例输精管切除和4例精液参数正常cfs-miRNA,通过RT-qPCR方法对筛选出的miRNAs进行验证。结果：在精液参数正常精浆中,共发现84个miRNAs浓度为输精管切除精浆4倍以上。RT-qPCR结果证实有61个miRNAs主要来自睾丸和附睾。其中,有属于5个miRNA家族的28个miRNAs分布于X染色体上。结论：本研究筛选和鉴定了主要来自睾丸和附睾的精浆miRNAs,这些miRNAs有望作为无创性标记物用于精子发生和成熟异常的病因和病理生理研究。第二部分人精浆中附睾miRNAs作为特发性弱精子症无创标记物的初探背景与目的：游离miRNA在妊娠、肿瘤、心血管疾病、组织损伤等生理病理过程中表达失调,有望成为研究和诊断多种疾病的新分子标志物。我们前期在人精浆游离miRNA中鉴定了一些主要来源于睾丸和附睾的miRNAs。miRNA分子在精子发生和精子成熟中起重要调控作用。由此推测,附睾来源的miRNAs可能与精子成熟密切相关,在一些特发性弱精子症患者中存在miRNA失调状态,这种失调可通过定量分析cfs-miRNA得到反映,而精浆中失调的附睾miRNAs可作为特发性弱精子症的无创性标记物。本实验以特发性弱精子症为对象,对这一推测进行证实。方法：收集20例精液参数正常和22例弱精子症的精液,弱精子症患者无生殖道解剖结构异常,无精索静脉曲张,无隐睾症、腮腺炎、食用生棉籽油、睾丸扭转、高烧、生殖道感染、毒瘾、暴露化学物质或高温环境病史。精液培养结果为阴性,促性腺激素、催乳素、睾酮、雌二醇、卵泡雌激素和促黄体生成素的血清学检查结果正常。排除精浆PH值和精液液化异常,且未出现已知的可能性遗传学病因、免疫疾病和其它系统性疾病。通过逆转录荧光定量PCR检测附睾来源的13个cfs-miRNAs (miR-888、miR-890、 miR-891a、miR-891b、miR-892a、miR-892b、miR-660、miR-421、miR-221、miR-200b、 miR-220c.miR-187和miR-181c)在精液参数正常精浆和弱精子症精浆中含量的差异性,以普遍表达的miR-30d, miR-93和miR-107作为内参,取3个内参的平均CT值作为内参CT值来计算cfs-miRNAs的相对含量。结果：5个来源于附睾的游离miRNAs (miR-888、miR-890、miR-891a、miR-891b和]miR-892a)相对含量在特发性弱精子症的精浆中表现为明显下降,差异有显著性意义(P<0.05)。这些附睾特异性表达]miRNAs均属于X-染色体miR-890/891a家族,在附睾形态发生和精子成熟中有重要作用。另外,8个来源于附睾的游离miRNAs (miR-892b、 miR-660、miR-421、miR-221、miR-200b、miR-220c、miR-187和miR-181c)相对含量在两种精浆标本中没有明显的差异,差异无显著性意义(P>.05)。结论：附睾来源的miRNA与精子成熟密切相关,cfs-miRNAs(miR-888、miR-890、 miR-891a、miR-891b和miR-892a)的下调可能是导致精子活力下降的表观遗传学病因,也可能是其它不利于精子活力病因的中间作用环节。cfs-miRNA可望成为无创性研究部分特发性不育表观遗传病因和机制的新分子标志物。第三部分人精浆游离DNA中睾丸和附睾启动子甲基化谱的鉴定背景与目的：DNA甲基化在精子发生与成熟的甲基化重建中起重要作用,已证实在不育男性睾丸或精子中存在一些基因启动子的异常甲基化。我们之前在人精浆发现高浓度的游离DNA。我们假设在人精浆游离DNA (cell-free seminal DNA, cfsDNA)能检测到一些睾丸和附睾特异性甲基化启动子,从而有望为精子发生和精子成熟异常引起的男性不育提供无创性表观遗传标记物。为此,我们鉴定人精浆中睾丸和附睾特异性甲基化启动子。方法：我们通过NimbleGen HG18Refseq启动子芯片分别检测6例精液参数正常混合cfsDNA和6例输精管切除混合cfsDNA中的启动子甲基化情况,筛选睾丸和附睾特异性甲基化启动子。分别通过MeDIP-qPCR和MethyLight在精液参数正常和输精管切除的cfsDNA中检测甲基化芯片筛选的10个和9个不同睾丸和附睾特异性甲基化启动子。通过Gene Ontology分析对睾丸和附睾特异性甲基化基因进行功能归类。结果：我们鉴定了367个睾丸和附睾特异性低甲基化基因和134个睾丸和附睾特异性高甲基化基因的启动子。MeDIP-qPCR证实启动子芯片结果中的8个睾丸和附睾特异性低甲基化启动子(DAZ1、DNMT3L, GML、HOXA5、MSH4、MORC1、PRAME和SNURF), MethyLight分析证实了启动子芯片结果中的2个睾丸和附睾特异性高甲基化启动子(CHRFAM7A和USP28和6个睾丸和附睾特异性高甲基化启动子(ERRF1、 FBRS、GLTPD1、HSF1、VPS16和ZNF623)。Gene Ontology分析显示一些睾丸和附睾特异性甲基化基因与男性生殖、附睾重吸收、分泌和防御功能有关。结论：我们在cfsDNA中检测到睾丸和附睾特异性甲基化启动子,这些启动子可能作为无创性表观遗传标记物用于男性不育的研究和诊断。第四部分NOA患者cfsDNA中睾丸特异性甲基化启动子定量背景与目的：DNA甲基化在精子发生中起重要作用,睾丸组织获取困难限制了其在人的研究。我们前期在cfsDNA中鉴定了睾丸／附睾特异性甲基化启动子。精子发生过程中,从生殖祖细胞开始到最后精子形成逐步重建基因启动子甲基化,我们推测睾丸特异性甲基化启动子在不同病理类型NOA患者睾丸中的甲基化状态会有一定差异,其差异能通过分析对应cfsDNA的启动子甲基化水平得到反映。而且,可能发现生精功能低下与其它无精子形成的NOA之间的差异性甲基化启动子,这些差异性甲基化启动子具有预测睾丸精子提取的潜力。本实验主要通过检测不同病理类型NOA患者睾丸及精浆中睾丸特异性甲基化启动子的甲基化状态对这一推测进行证实。方法：收集14例NOA睾丸组织(5例生精阻滞和9例生精功能低下)和相应精液(5例生精阻滞和4例生精功能低下),用于研究所选取的启动子甲基化在睾丸组织结果与cfsDNA结果,及睾丸组织基因表达的相关性；收集68例NOA患者精液(17例唯支持细胞综合征、25例生精阻滞、26例生精功能低下)和24例精液参数正常精液,用于研究所选取启动子甲基化水平差异。通过MethyLight检测14例睾丸和101例cfsDNA中6个睾丸特异性甲基化启动子(ACRBP, CCNA1、CIB1、DMRT1、HSF1和MORC1)相对甲基化水平。通过逆转录定量PCR检测14例睾丸中6个基因相应mRNA表达水平。分析9例睾丸组织启动子甲基化水平和对应精浆启动子甲基化水平相关性,分析14例睾丸组织基因启动子甲基化水平与相应的mRNA水平的相关性,分析68例不同病理类型NOA及24例精液参数正常男性精液启动子甲基化水平变化,比较26例生精功能低下和42例非生精功能低下的NOA患者cfsDNA的启动子甲基化水平差异并进行ROC曲线分析。结果：睾丸中ACRBP、CIB1、CCNAl, DMRT1、HSF1和MORC1启动子甲基化水平与对应cfsDNA中启动子甲基化水平相关系数分别为0.90、0.94、0.79、0.99、0.90和0.92,与睾丸相应mRNA表达水平相关系数分别为-0.667、-0.586、-0.609、-0.584、-0.806和-0.774。不同病理类型NOA及精液参数正常精液的ACRBP, CIB1, CCNA1, DMRT1, HSF1和MORC1启动子甲基化水平呈动态变化趋势。其中,CCNA1和DMRT1启动子甲基化水平在生精功能低下NOA与非生精功能低下NOA差异明显,P值分别为0.032和0.065。CCNA1和DMRT1甲基化启动子预测生精功能低下NOA患者的敏感性分别为27.27%和36.36%,特异性均为94.44%。结论：NOA患者cfsDNA的睾丸特异性启动子甲基化水平能反映对应睾丸的启动子甲基化水平,这些启动子可望成为无创性标记物用于NOA病因和发病机制研究,或生精功能低下NOA预测。