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中国对虾主要分布在黄海和渤海等沿海地区,是我国海水养殖的主要物种,具营养丰富和生长速度快等特点。海域间海水盐度差异以及连续暴雨造成池塘盐度急剧下降,养殖户为增加养殖效益会选择提高养殖密度,低盐度和高密度会对中国对虾生理功能及行为产生影响,影响存活率,造成产量和效益减少。以cAMP为第二信使的cAMP信号通路的主要效应是通过腺苷酸环化酶调节靶细胞内cAMP的水平,通过活化cAMP依赖的PKA使下游靶蛋白磷酸化,主要参与生物体内细胞增殖与分化、基因表达和调节酶活等过程,从而影响细胞代谢和细胞行为,进而影响信号通路的下游事件。本研究通过分析急性低盐和高密度胁迫下行为参数,检测cAMP信号通路中基因表达以及生理生化指标的变化,探讨cAMP信号通路中相关基因参与中国对虾急性低盐和高密度胁迫下的适应调节过程,为中国对虾在环境适应方面提供基础数据,为中国对虾的健康养殖提供数据。主要研究内容如下:1.急性低盐和高密度胁迫对中国对虾行为的影响在盐度为10的胁迫下活动频率和游走距离显著高于对照组（P<0.05）,48h时分别是49%和55 cm,分别是对照组的24.5和9.6倍,未出现攻击行为。急性低盐胁迫下中国对虾通过增加运动水平来调节自身,适应环境,推测原因可能是急性低盐胁迫下需要消耗大量能量来进行渗透调节,对虾为减少能量消耗且对虾间间距未变从而导致未出现攻击行为。在密度为100尾/m2的胁迫下活动频率和游走距离显著高于对照组（P<0.05）,活动频率48 h时是38.7%,是对照组的19.4倍,游走距离12 h时是283.8 cm,是对照组的94.6倍,对照组未出现攻击行为,实验组攻击频率在48 h时达到最高值,是10%。推测是因为高密度下对虾个体间间距减小,个体间接触的机会增多,为避免个体间相互影响,对虾需要通过频繁移动来保持一定距离和间隔,来找寻空间和资源,移动增多,对虾攻击几率增大。2.中国对虾Gs、PKA和Na+-K+-ATPase基因克隆和组织表达利用RACE克隆技术获得中国对虾Gs、PKA和Na+-K+-ATPase基因全长。得到Gs、PKA和Na+-K+-ATPase基因全长分别为1692 bp、2381 bp和3960 bp,开放阅读框长度分别为1140 bp、1056 bp和3117bp,分别编码379个、351个和1038个氨基酸。Gs蛋白结构为不稳定亲水蛋白,PKA和Na+-K+-ATPase为稳定亲水蛋白。同源及进化分析显示与Gs和Na+-K+-ATPase同源性最高的是凡纳滨对虾,PKA与斑节对虾同源性最高。利用荧光定量PCR技术检测Gs、PKA和Na+-K+-ATPase基因组织表达情况,结果显示Gs表达量较高的组织是鳃、肝胰腺和心脏,PKA是肌肉、鳃和肝胰腺,Na+-K+-ATPase是鳃、肝胰腺、肌肉、胃和肠道。3.急性低盐胁迫对中国对虾cAMP信号通路内基因表达和生理生化指标的影响荧光定量PCR检测急性低盐胁迫下Gs、PKA和Na+-K+-ATPase基因在鳃和肝胰腺中的表达变化。结果显示Gs基因表达量显著高于对照组（P<0.05）,鳃中12 h时是对照组的2.0倍,肝胰腺中24 h是对照组的1.9倍;PKA基因相对表达量显著高于对照组（P<0.05）,鳃和肝胰腺中12 h时分别是对照组的34.3和1.4倍;Na+-K+-ATPase基因显著高于对照组（P<0.05）,鳃和肝胰腺中12 h时分别是对照组的1.9和1.6倍。检测鳃和肝胰腺DA、Gs、cAMP、PKA含量和AC、Na+-K+-ATPase活力。结果显示DA含量显著高于对照组（P<0.05）,鳃12 h时是对照组的1.3倍,肝胰腺24 h时是对照组的1.2倍;Gs含量显著高于对照组（P<0.05）,鳃中12 h时是对照组的1.4倍,肝胰腺中24 h时是对照组的1.9倍;cAMP含量在鳃中12 h时是对照组的1.4倍,肝胰腺中24 h时是对照组的1.3倍,显著高于对照组（P<0.05）,;PKA含量在鳃和肝胰腺中12 h时都是对照组的1.2倍,显著高于对照组（P<0.05）,。AC活力显著高于对照组（P<0.05）,鳃中12 h时是对照组的1.5倍,肝胰腺中24 h时是对照组的1.5倍;Na+-K+-ATPase活力显著高于对照组（P<0.05）,鳃中12 h时是对照组的1.5倍,肝胰腺中24 h时是对照组的2.0倍。根据上述结果初步推测cAMP信号通路内基因在中国对虾应对急性低盐胁迫过程中起重要的调控作用。对Gs和PKA基因进行干扰,48 h累计死亡率显著高于对照组（P<0.05）,分别为32%和20%,推测Gs和PKA基因在中国对虾受到急性低盐胁迫后发挥重要作用。干扰Gs基因后PKA和Na+-K+-ATPase基因较对照组整体呈下调表达,表明Gs基因对下游PKA和Na+-K+-ATPase基因为正调控。结合行为观察实验结果,推测急性低盐胁迫导致的渗透压失衡间接引起了行为进行适应性变化,cAMP通路通过提高整体表达水平调节渗透压来稳定生理机能。4.高密度胁迫对中国对虾cAMP信号通路内基因表达和生理生化指标的影响荧光定量PCR检测高密度胁迫下Gs、PKA和Na+-K+-ATPase基因在鳃和肝胰腺中的表达变化。结果显示Gs基因表达量显著高于对照组（P<0.05）,鳃和肝胰腺中12 h时分别是对照组的2.6和1.7倍;PKA基因显著高于对照组（P<0.05）,鳃中6 h时是对照组的1.8倍,肝胰腺中72 h时是对照组的1.9倍;Na+-K+-ATPase基因显著高于对照组（P<0.05）,鳃中12 h时是对照组的10.3倍,肝胰腺中6 h时分别是对照组的4.9倍。检测鳃和肝胰腺DA、Gs、cAMP、PKA含量和AC、Na+-K+-ATPase活力。结果显示DA含量显著高于对照组（P<0.05）,鳃中6 h时是对照组的1.4倍,肝胰腺中48 h时是对照组的1.1倍;Gs含量显著高于对照组（P<0.05）,鳃中12 h时是对照组的1.9倍,肝胰腺中72 h时是对照组的1.7倍;cAMP含量显著高于对照组（P<0.05）,鳃中6 h时是对照组的2.3倍,肝胰腺中12 h时是对照组的1.3倍;PKA含量显著高于对照组（P<0.05）,鳃和肝胰腺中6 h时分别是对照组的1.4和1.3倍;AC活力显著高于对照组（P<0.05）,鳃和肝胰腺中6 h时分别是对照组的1.7和1.5倍;Na+-K+-ATPase活力显著高于对照组（P<0.05）,鳃和肝胰腺中6 h时分别是对照组的1.4和1.6倍。初步推测cAMP通路在中国对虾高密度适应过程中起重要作用。对Gs和PKA基因进行干扰,48 h累计死亡率显著高于对照组（P<0.05）,分别为28%和24%,推测Gs和PKA基因在高密度胁迫下的调节过程发挥重要作用。干扰Gs基因后PKA和Na+-K+-ATPase基因较对照组整体呈下调表达,表明Gs基因对下游PKA和Na+-K+-ATPase基因为正调控。结合行为观察结果,推测cAMP通路参与高密度胁迫下中国对虾适应过程。