论文部分内容阅读
芳烃化合物是环境中的一类重要污染物，目前已发现多种微生物能够降解芳烃污染物。完整而有效的芳烃代谢通常包括以下两个方面:参与芳烃化合物降解的完整酶系和保证该酶系有效表达的调控系统。作为单硝基酚的代表，4-硝基苯酚(PNP)被美国环保署列为优先污染物。目前，已分离到多株能够降解PNP的细菌，而且对其代谢途径也有了深入的研究。然而对于PNP代谢的调控报道却非常有限:目前只有在革兰氏阳性菌Rhodococcus sp.strain PN1中通过基因突变和转录活性分析实验确认了一个AraC家族的调控蛋白NphR参与了PNP代谢的调控;在革兰氏阴性菌Pseudomonas putida DLL-E4中通过基因敲除和转录组分析验证了一个LysR家族调控蛋白PnpRDLL-E4参与了PNP下游代谢（对苯二酚的降解）的调控，而这两个调控蛋白的调控机理未有报道。Pseudomonas sp.strain WBC-3是一株能够利用PNP生长的革兰氏阴性菌，且通过对苯二酚(HQ)降解PNP。与PNP代谢相关的基因簇位于三个操纵子上:pnpA、pnpB和pnpCDEFG。目前已鉴定了LysR家族调控蛋白PnpR参与调控这三个操纵子。但当启动子突变之后，发现其中负责PNP下游代谢的pnpCDEFG的启动子活力与上游代谢的pnpA、pnpB表现明显不同。基于这个结果，推测在菌株WBC-3中可能还存在另外一个调控蛋白参与了操纵子pnpCDEFG的转录调控。 本研究主要围绕负责PNP下游代谢操纵子pnpCDEFG的转录调控进行。通过生物信息学分析，发现PNP下游代谢可能有关的另外一个调控蛋白编码基因pnpM。pnpM编码一个LysR家族调控蛋白PnpM，其与PnpR的氨基酸一致性为44％。pnpM基因敲除后，敲除菌株不再能以PNP作为唯一碳源进行生长，但是仍然能将PNP代谢为HQ，造成HQ的积累。体内实验结果表明基因pnpM是PNP完全降解所必须的。通过RT-qPCR实验检发现经pnpM基因的敲除对pnpC基因的转录影响要大一些，而且经PNP诱导后，PnpM对于pnpC基因的转录是一个激活蛋白。分子筛实验发现调控蛋白PnpM在天然状态下是以四聚体形式存在的。通过凝胶阻滞和启动子活力检测实验发现，PnpR参与操纵子pnpA和pnpB的转录激活，而调控蛋白PnpM和PnpR都参与操纵子pnpCDRFG的转录激活。DNaseⅠ印迹实验表明，在诱导物PNP不存在时，PnpM和PnpR与pnpCDEFG的结合区域是相同的27bp，加入诱导物PNP后，结合区域都变大，分别是38bp和39bp。而且对于PNP下游代谢调控的诱导物是PNP，而不是HQ。通过启动子突变实验发现，调控结合位点(RBS)的完整性以及激活结合位点(ABS)的完整性对于调控蛋白PnpM或者PnpR激活pnpCDEFG操纵子的转录都是必须的。总体而言，在菌株WBC-3代谢PNP的过程中，调控蛋白PnpR参与调控起始的两个反应，而PNP下游代谢的过程是由调控蛋白PnpM和PnpR共同调控的。 本研究是基于以前的结果，发现两个LysR家族调控蛋白都参与PNP代谢的调控。特别是调控蛋白PnpM参与操纵子pnpCDEFG的调控，完善了PNP代谢调控的机制，为PNP代谢调控提出了新的视角。从分子生物学和生物化学水平上进一步完善了微生物降解PNP的代谢调控机理，从而对阐明硝基酚类物质乃至芳香烃的代谢调控机理以及其适应性进化机制具有重要的理论意义。 另一部分研究是关于多组份四氢呋喃单加氧酶的研究。四氢呋喃(THF)是一种工业环醚类污染物。Pseudonocardia sp.strain K1能利用THF为唯一碳源进行生长。推测基因簇thmADBC编码三组份的THF单加氧酶ThmADBC，其中THF单加氧酶的还原酶组份的活性已经被鉴定，但是整个单加氧酶的酶学性质研究的报道未见报道，目前仅通过生物转化证明其能转化THF，但产物未鉴定。本研究通过序列分析，THF单加氧酶ThmADBC是一种新的多组分含双核铁单加氧酶，将其整个基因簇在大肠杆菌中表达，检测到粗酶液的活性，但是未检测到产物。将单加氧酶ThmADBC的三个组份分别在体外进行表达纯化，其中偶联蛋白组份ThmC和还原酶组份ThmD已成功纯化，而且也验证了ThmD的活性。加氧酶组份ThmAB目前也已得到表达纯化，但是三组份的纯酶酶活以及产物都未检测到。