研究背景流感是一种由流感病毒引起的急性呼吸系统传染病,最近几十年,具有高度传染性的流感病毒很容易造成季节性大流行,对全球公共卫生构成了严重威胁。H1N1是流感病毒中的一种亚型,由于H1N1可直接感染人,导致人类患病或死亡,因此加强对H1N1监控和检测,在减少世界经济损失和提高人类卫生健康方面,都具有深远的现实意义。现有的检测手段如传统的核酸分析通常需要专业人员在有复杂而昂贵设备的实验室中进行。随着对H1N1监控和检测需求的增长,低成本易于操作和快速的检测方法越来越受到关注。因此,研发操作简单、反应时间短、恒温条件检测H1N1流感病毒的方法显得尤为重要。研究目的本课题组拟建立一种基于磁珠适体和等温扩增技术对H1N1流感病毒的检测方法,探索两种不同信号放大方式的扩增效果,利用目视比色检测扩增结果,为H1N1流感病毒简便快速的诊断提供了新的思路,为流感早期检测防控奠定理论依据和实践基础,同时进行环状适体的研究,对通过改造适体增强适体适用性方面提供了可能。研究方法(1)通过点杂交,凝胶阻滞,纳米金比色的表征方法对适体亲和力和特异性进行验证。(2)基于磁珠适体的制备,采用双适体结合双引物滚环扩增和自生成引物滚环扩增方式检测H1N1流感病毒。(3)选择不同显色剂对反应体系,反应条件进行优化,实现对扩增产物进行可视化检测,建立可视化检测H1N1流感病毒的方法。(4)利用锁式探针成环原理对已有适体进行环化,通过点杂交,96孔板法对其进行亲和力的鉴定。研究结果(1)以靶向H1N1流感的适体作为研究对象,通过文献查阅获取3条针对完整病毒的适体开展实验。利用不同表征方法对该适体进行验证,明确得到能够特异性结合H1N1流感病毒的适体。(2)将适体和等温扩增技术相结合,基于双适体实验方案设计两种信号扩大方式RCA与pg-RCA,实现对H1N1流感病毒检测,比较两种方式并对其进行优化,最终选择了RCA的方式进行扩增(3)对羟基萘酚蓝,钙黄绿素,中性红,SYBR GREEN I几种显色剂进行比较,优化条件找到最适反应指示剂对H1N1流感病毒进行特异性检测,最低检测限为10ng/μL,并实现对实际样品的检测。(4)在已有的直链适体基础上,改造适体进行环化通过点杂交和96孔板法与未环化适体进行亲和力的比较,确定了环状适体同样具有特异性结合H1N1流感病毒的能力。结论本论文提出一种基于磁珠适体和等温扩增技术检测H1N1流感病毒的方法,采取不同类型的表征方法对适体进行验证,探索两种信号扩大方式的可行性,利用不同显色剂对扩增产物进行判定,从而建立可视化检测H1N1流感病毒的体系,不需要传统的检测设备,从方法学上增加了对H1N1流感病毒的检测手段,不受环境和条件的影响,可以用于基层检测,同时环状适体的研究表明改造适体对适体功能产生影响,为新型检测方法的建立提供了理论依据,具有广阔的应用前景。