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淋巴管系统负责将组织液、外漏的蛋白和细胞回输到血管。淋巴管系统也是机体免疫监视系统的重要组成部分。因此,在机体发育及病理情况下如炎症和淋巴水肿,淋巴管系统起十分重要的作用。肿瘤扩散的重要机制之一是肿瘤细胞离开原发部位,通过淋巴系统转移到淋巴结,因此,淋巴系统在肿瘤进展过程中有重要的作用。淋巴结侵犯是决定肿瘤分期的重要因素,也是多种实体肿瘤包括肺癌、乳腺癌和前列腺癌预后的重要因子。近年研究证实,肿瘤诱导的淋巴管生成促进了癌细胞的转移性扩散,导致肿瘤患者预后差、生存率降低。目前多项研究发现血管内皮生长因子-C(VEGF-C)和血管内皮生长因子-D(VEGF-D)是最重要的两个淋巴管生成因子,VEGF-C或VEGF-D可通过结合淋巴管内皮细胞(LEC)上的血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3),继而促进LEC增殖、迁移和管状结构形成,从而诱导淋巴管生成。因此,抑制LEC形成淋巴管以及抑制淋巴管生成因子的作用是寻找治疗肿瘤转移及其它淋巴管生成相关疾病的重要途径。目的研究青蒿素(ART)对Lewis肺癌(LLC)移植瘤淋巴管生成和淋巴结转移的作用,并初步探讨其作用机制。方法1.建立C57BL/6小鼠LLC耳后近背侧皮下移植瘤模型;2.荷瘤小鼠被分为对照组和ART组(每组n=25)。ART组肿瘤移植后第2天开始灌胃给予ART(50 mg/kg),每两天一次,持续2周,测定肿瘤体积变化。第30天处死小鼠(每组n=10),称量瘤重、肺湿重,检测肺转移结节数,并检查全身淋巴结转移情况,包括同侧颈上淋巴结群、对侧颈上淋巴节群、臂部淋巴结群、椎旁淋巴结群、颈深淋巴结群、纵隔淋巴结群和肾上腺淋巴节群。免疫组化进行LYVE-1和VEGFR-3染色,以LYVE-1阳性淋巴管计算微淋巴管密度(LMVD)。RT-PCR和Western blotting检测VEGF-C mRNA和蛋白水平。另取两组小鼠,使用ART处理后,计算60天内中位生存期和生存率(每组n=15);3.不同浓度ART处理LLC细胞后,Western blotting和RT-PCR分别检测VEGF-C蛋白和mRNA水平;4.小鼠腹腔注射不完全弗氏佐剂(IFA)诱导淋巴管瘤形成;体外分离并培养LEC,免疫荧光和Annexin V/PI双染对LEC进行鉴定;5.LEC经ART处理后,MTT实验检测细胞增殖,Transwell实验检测细胞迁移,基质胶实验检测管样结构形成。结果1.LLC皮下移植后第30天,观察对照组(每组n=10)同侧颈上、对则颈上转移率为分别为100%和90%,而ART组分别为60%和40%,两者具有显著性差异(P＜0.05)。此外,ART组腋窝、椎旁和肾上腺淋巴结转移率也显著低于对照组(P＜0.05)。而颈深和纵隔淋巴结转移率在对照组分别为70%和90%,ART组为50%和80%,两组间无显著性差异(P＞0.05)。此外,ART组双肺转移发生率为50%,对照组为100%;两组双肺转移结节数分别为16.5±2.1和5.6±1.8(P＜0.05);移植瘤LMVD分别为29.9±3.4和11.0±2.7(P＜0.05)。然而,ART组和对照组移植瘤重分别为1.96±0.32和1.78±0.18,两组间无统计学意义(P＞0.05)。2.小鼠移植后第60天,生存率分析表明:两组小鼠生存率(每组n=15)比较具有显著差异(P＜0.05)。移植瘤小鼠给予ART后,中位生存期由38天提高至54天。3.定量RT-PCR和Western blotting表明,ART组和对照组移植瘤VEGF-C mRNA和蛋白表达具有显著差异(P＜0.05)。体外实验进一步显示,不同浓度(5、10、20μmol/L)ART显著降低LLC细胞表达VEGF-C mRNA和蛋白(P＜0.05)。4.小鼠腹腔注射IFA成功诱导小鼠腹腔良性淋巴管瘤形成:从诱导的新生物中分离得到LYVE-1阳性细胞;流式细胞仪结果显示LYVE-1阳性细胞数为60%-86%;免疫荧光结果表明LYVE-1表达在细胞膜和细胞浆。5.凋亡结果显示,ART刺激的LEC发生固缩,染色质边集,具有典型的凋亡细胞特征;Annexin V/PI双染显示:对照组LEC凋亡率为9.28%,10μmol/L和20μmol/LART处理的LEC凋亡率分别增加至42.36%和53.37%。MTT结果显示,5、10、20和40μmol/LART对LEC细胞生长抑制率分别为7.78%、23.50%、40.72%和62.72%,具有显著的剂量-效应关系。此外,细胞迁移实验和基质胶实验显示,不同浓度的青蒿素对LEC迁移和管状结构形成均具有显著抑制作用,低浓度ART(5μmol/L)对LEC迁移和管状结构形成的抑制率分别为35.2%和54.5%,高浓度ART(20μmol/L)的抑制率分别为77.5%和71.7%。结论ART具有抑制LLC移植瘤淋巴管生成和淋巴结转移的作用,其作用机制与其下调肿瘤细胞表达VEGF-C、诱导LEC凋亡、抑制LEC增殖、迁移和管状结构形成有关。