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猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一种严重危害养猪业的重大传染病。临床上多种病原共感染的情况十分普遍,尤其是一些重要的、新发病毒的共感染,导致猪病越来越复杂。由于我们对新发病毒的认识不够,给猪病的防控带来了新的挑战。本研究对实验室鉴定的CSFV 阳性样品进行PK-15细胞分离时发现8份样品出现了细胞病变(Cytopathic effect,CPE),由于CSFV在PK-15细胞上不产生CPE,表明这些样品还携带有其他病毒。因此,我们对这些产生CPE的病毒样品进行了鉴定。实验首先采用带毒传代和接毒传代的方式对本实验室保存的58份CSFV阳性样品进行了 PK-15细胞分离,共成功分离获得30株CSFV,经5-10次传代后病毒滴度达到105.5-7.5TCID50/mL。这些分离的 CSFV 毒株中,有 3 株(GDFS2-2018、GDFS9-2018 和GD5-2019)出现了细胞变圆和脱落等CPE,为鉴定与CSFV共感染的病毒,实验利用高通量测序对这3个毒株以及实验室前期分离的出现CPE的5株CSFV毒株(JL16-2017、JL18-2015、GX1484-2017、HuB48-2017 和 AH29-2014)进行了病毒基因组测序,结果表明这些与CSFV分离株共感染的病毒分别是盖塔病毒(GETV-GDFS2-2018和GETV-GDFS9-2018)、猪捷申病毒(PTV-JL 16-2017 和 PTV-JL18-2015)、猪萨佩罗病毒(PSV-GX1484-2017 和 PSV-HuB48-2017)、塞内卡病毒(SVA-GD5-2019)和猪星状病毒5型(PAstV5-AH29-2014)。同时,利用中和试验(PTV、PSV和PAstV5)和终点稀释法(GETV和SVA)获得了上述5种病毒的纯培养物。2株盖塔病毒(GETV-GDFS2-2018和GETV-GDFS9-2018)分离自广东省佛山市,病毒基因组全长均为11,689 nt,二者同源性为100%,与37株参考毒株的全基因组序列核苷酸同源性为96.1%-99.7%,其中与河南猪源毒株HNJZ-S2的同源性最高,但与广东省2018年8月首次发现的马源毒株GZ201808同源性为98.6%,表明二者的感染来源不同,这也是广东省首次发现有猪盖塔病毒的流行。系统进化分析显示,GETV-GDFS2-2018和GETV-GDFS9-2018属于在我国占主导地位的Group Ⅲ群。GETV-GDFS2-2018在PK-15细胞上快速复制,18h后开始出现病变,30h细胞全部脱落,病毒滴度在24 h达到峰值109.3 TCID50/mL。GETV-GDFS2-2018粒子为球形,直径约70 nm,在细胞间隙中可观察到病毒粒子。猪捷申病毒PTV-JL16-2017和PTV-JL1 8-2015来自吉林省,病毒基因组全长分别为7,158 nt和7,100 nt,二者同源性为99.8%,属于基因11型。超薄切片发现,PTV主要聚集在细胞质中。猪萨佩罗病毒PSV-GX1484-2017和PSV-HuB48-2017分别来自广西和湖北,病毒基因组全长分别为7,572nt和7,578 nt,二者同源性为89.8%。系统进化分析显示,PSV-GX1484-2017与HuN21的同源性最高(90.3%),而PSV-HuB48-2017与HuN10的同源性最高(93.4%)。猪塞内卡病毒SVA-GD5-2019分离自广东,病毒基因组全长为7,286nt,与80个国内外参考毒株的核苷酸同源性为94.9%-98.2%,与我国大多数分离株共处于进化Ⅰ群。SVA-GD5-2019在PK-15细胞上的增殖速度很快,接种24 h后细胞完全脱落,病毒滴度可达1010.16 TCID50/mL。SVA-GD5-2019粒子呈球形,直径约为25 nm,病毒粒子在细胞质呈晶格状排列。猪星状病毒5型毒株PAstV5-AH29-2014分离自安徽省,是国际上首次分离的PAstV5毒株,病毒基因组全长为6,448 nt。序列分析发现,PAstV5-AH29-2014与日本分离株PAstV5-Ishi-1m1-1同源性最高(87.8%),这两个毒株属于基因PAstV5-2亚型。电镜观察发现,PAstV5-AH29-2014粒子呈球形,直径约为30 nm,同时病毒粒子在细胞质中呈晶格状排列,且包裹在囊泡中。本研究进一步证实了猪源病毒混合感染的普遍性和复杂性。为了确定临床发病猪携带的病毒,应该利用宏病毒组学手段对样品进行精准检测。此外,本研究获得的成果为相关猪病毒性传染病的预防和控制提供了重要的科学数据,有助于科学合理的防控策略的制定。