论文部分内容阅读
目的:CRISPR/Cas系统是一种新型的基因组编辑技术,Cas9核酸酶能够通过20bp的引导序列而导向特异的基因组位点而使DNA发生双链断裂。同时microRNA是一类长度约22nt的非编码小RNA,在各种生物过程中起到调节功能,如细胞的生长,增殖以及凋亡等。本文通过针对mir-505基因位点,设计两条sgRNA,从而利用CRIPSR/Cas系统对mir-505基因位点进行编辑,探讨CRISPR/Cas系统对靶点的剪切效率的影响因素。为了更深入地研究mir-505的生物学功能,我们尝试将mir-505基因整体敲除。因此在CRISPR/Cas系统介导下,通过同源重组作用将mir-505基因整体替换,从而得到mir-505敲除细胞。随后,我们以mir-505敲除细胞为研究对象,进行各项生物学特性检测。方法:针对mir-505基因设计两条具有不同GC%的sgRNA,随后分别将它们构建入sgRNA表达载体和Cas9蛋白/sgRNA共表达载体。其中Cas9蛋白/sgRNA共表达载体能够同时表达sgRNA和Cas9蛋白,从而实现sgRNA和Cas9蛋白的共传递。分别将构建好的表达载体利用脂质体转染法转染入哺乳动物细胞中,通过T7E1assay和DNA测序的方法检测其剪切效率。结果证明实验所设计的CRISPR/Cas系统的确能够在mir-505靶点起作用,并且揭示不同的CRISPR/Cas系统对靶点剪切效率有所差异。为了整体敲除mir-505基因,我们将打靶载体和CRISPR/Cas系统载体一同转染细胞,通过同源重组修复将mir-505整个基因进行整体替换敲除,再利用G418抗性筛选的方法得到mir-505敲除细胞。利用Real-Time PCR对mir-505基因拷贝数检测以及MTT法测定细胞生长速度的方法比较mir-505敲除细胞和野生型细胞间的差异。结果:成功构建靶向mir-505基因位点的CRISPR/Cas系统载体,能够正确靶向mir-505位点,并在靶点处发生双链剪切。结果显示CRISPR/Cas系统对靶点的剪切效率与Cas9蛋白和sgRNA的剂量成正比;当sgRNA与Cas9蛋白共传递时,也能够明显提高靶点的剪切效率;此外,对靶向mir-505基因的两个不同位点的sgRNA而言,较高GC%的sgRNA有较高的剪切效率。将CRISPR/Cas系统载体和打靶载体共转染哺乳动物细胞,经G418抗性筛选后得到的mir-505敲除细胞。经Real-Time PCR对mir-505基因拷贝数检测发现CRISPR/Cas系统所介导的同源重组更可能够得到mir-505单等位基因敲除细胞,而不是双等位基因敲除。经细胞生长速度测定,发现和野生型细胞相比,敲除细胞的生长速度明显减慢,且两者差异日渐增大。为了获得mir-505完全敲除的细胞,我们尝试在mir-505单等位基因敲除细胞的基础上再一次利用同源重组进行敲除,得到mir-505双等位基因敲除细胞。结论:本研究利用CRISPR/Cas系统靶向哺乳动物细胞的mir-505基因,使得mir-505基因发生突变。CRISPR/Cas系统对靶点的剪切效率和sgRNA和Cas9蛋白的剂量、sgRNA是否和Cas9蛋白共传递以及sgRNA的GC%有关。而mir-505敲除细胞的生长速度明显减慢,说明mir-505在调控细胞的生长,增殖过程中起到一定的调控作用。