第一部分：逆转录病毒载体和慢病毒载体的安全性比较研究背景：逆转录病毒载体广泛应用人类基因治疗试验中。然而载体随机插入可能会引起宿主附近基因的激活。逆转录病毒和慢病毒载体越来越多的应用于干细胞基因矫正中。由于插入诱变导致的干细胞表型改变,可能会影响其子代细胞及其分化发育性能。目的：确定病毒载体插入部位的选择机制及对宿主基因表达的影响。方法：分类转染的Jurkat细胞克隆,用LM-PCR方法对病毒载体插入位点进行作图。并将获得的插入位点附近序列与人类基因组草图(UCSC Human Genome Project Working Draft)进行比对。用实时荧光定量逆转录PCR技术检测病毒载体插入对宿主基因表达的影响。结果：1)RV插入宿主基因组时偏好RIS,而LV没有类似倾向。2)RV喜好插入基因的转录起始区(TSS),而LV没有类似倾向。3)加入cHS4绝缘子后,使LV的插入模式向RV模式转变,即靠近TSS的增多。4)与LV不同,RV对宿主基因的活化频率较高,说明LV是较RV安全的载体。而且,RV可能会导致插入突变,这一特性可以用于研究基因是如何条件细胞增殖和分化的。5)宿主基因被活化与否,跟病毒载体插入位点与宿主基因启动子的远近无直接关系。结论：RV偏好插入RIS基因附近,该类基因多是调节细胞周期和凋亡的基因。宿主基因的活化可能与所在染色质的三维空间结构有关,使得RV增强子能够激活远处的宿主基因,而对就近的基因没有影响。RV和LV在对插入位点的选择上有显著的不同。第二部分：病毒载体技术在体细胞重编程阶段的应用背景：虽然逆转录病毒载体插入诱变的风险高于慢病毒载体,但是存在两个明显的优势,其一体细胞重编程效率较高,其二在于细胞阶段,逆转录病毒载体的MLV启动子自发沉默,有助于后继的iPSCs向各类终末细胞分化。脊髓肌肉萎缩症(SMA)是单基因遗传病,非常适合进行发病机制和基因矫正治疗的研究。SMA疾病特异性iPSCs细胞能够提供无限量的带有疾病特征的运动神经元细胞。目的：本实验室1)拟建立逆转录病毒载体转染正常人皮肤成纤维细胞,建立正常人iPSCs作为对照组。2)而后建立脊髓肌肉萎缩症(SMA)患者的iPSCs,探索疾病特异性iPSCs作为研究发病机制的细胞模型的可行性。3)进行重编程技术优化。方法：来自于正常人和SMA患者的皮肤成纤维细胞被染携带有4类转录调控因子的逆转录病毒载体。4周以后,iPSCs克隆被分离培养,并进行特性鉴定,包括：1)ES细胞特异性标记基因的表达,包括TRA-1-80, hBRIX, hDNMT, NODAL, TDGF1, GDF3, NANOG, REX13, hTERT, DPPA4,内源性Oct3/4, Sox2, Klf4 and C-myc。2)胚样体形成试验,及向三胚层的诱导分化,用于证实iPSCs细胞系的多向分化潜能。3)进行重编程技术优化。结果：(1)本实验室建立的正常iPSCs和SMA-iPSCs细胞系均具有自我更新和多向分化潜能。(2)在建立SMA-iPSCs细胞系的过程中,重编程效率类似于正常人成纤维细胞。(3)RV携带的外源基因在iPSCs细胞系中被沉默,而内源性转录因子被激活表达。(4)RV没有引起iPSCs细胞的分化阻滞。(5)重编程技术优化结果,把LV和转座子技术结合,具有可行性,但重编程效率显著降低。结论：(1)用RV成功重编程获得正常iPSCs细胞系和疾病特异性SMA-iPSCs细胞系。(2)重编程条件优化可考虑把病毒载体技术和非病毒技术结合起来,以达到高效安全的目的。第三部分：病毒载体技术在人诱导性多能干细胞基因矫正阶段的应用背景：基因矫正技术和小鼠胚胎干细胞技术结合,近年来进展显著。包括利用同源基因重组技术发展而来的“基因敲出”、“基因敲入”小鼠,以及体外基因矫正技术的临床试验。但是由于人类胚胎干细胞的伦理限制、成体干细胞来源受限,体外扩增技术尚无突破,以及基因矫正的安全性问题,使人类遗传性疾病的基因矫正研究进展缓慢。目的：1)在患者皮肤成纤维细胞中进行基因矫正的可行性；2)在疾病特异性SMA-iPSCs细胞系中进行基因矫正的可行性；3)矫正前后,细胞表型及运动神经元定向分化功能的改变。方法：构建LV-SMN-Neo载体,1)转染SMA成纤维细胞,而后进行Neo耐药基因筛选；2)建立无滋养细胞的iPSCs培养体系,并用上述载体转染SMA-iPSCs获得成功；3)建立iPSCs向运动神经元定向分化的方案,而后用免疫荧光技术,鉴定SMN蛋白的表达情况,及Tuj-1和HB9等神经元特异性蛋白的表达情况。结果：1)成功构建携带正常SMN基因、Neo耐药基因的慢病毒载体；2)在患者成纤维细胞水平,成功转染并筛选获得G418抗生素耐药的阳性克隆；3)转染细胞成功表达SMN蛋白,及细胞核内gem body数量的显著增加；5)在疾病特异性SMA-iPSCs水平进行转染时,成功获得SMN的特异性表达和细胞核内gem body数量的增加。6)运动神经元定向分化研究中,发现SMA-iPSCs细胞核内包含SMN蛋白的颗粒(gem body)明显减少。运动神经元定向分化过程中,正常人iPSCs可以形成正常的运动神经元,而SMA-iPSCs的运动神经元形成明显减少,神经元特异性蛋白(Tuj-1,HB9)表达减少,轴突形成减少,说明SMN蛋白缺失可能会导致运动神经元发育缺陷。7)进行基因矫正后的SMA-iPSCs向运动神经元定向分化能力明显改善,但仍低于正常对照组。结论：慢病毒载体转染体细胞和iPSCs细胞系进行基因矫正,均具有可行性。病毒转染后的阳性克隆,其神经元特异性蛋白表达谱及运动神经元定向分化功能均得到改善。