“十八反”是古今中医用药配伍禁忌经验总结的核心内容,为中医临床用药的安全有效发挥了重要作用。随着人类社会的进步和医疗健康需求的不断提高,中药安全性问题日益受到社会广泛关注。本论文得到国家重点基础研究发展计划(973计划)——“基于十八反的中药配伍禁忌理论基础研究”的资助,基于模式生物斑马鱼,通过观察甘遂-甘草、海藻-甘草、大戟-甘草和芫花-甘草各反药组合的急性毒性与相互作用研究,为“十八反”中“藻戟遂芫俱战草”各反药组合“相反”的客观界定提供实验依据。第一章文献研究第一节模式生物是现代科学研究中必不可少的重要试验材料,本章对目前比较常用的模式生物斑马鱼、果蝇、线虫等进行了介绍,主要包括它们的发生发展及各自所具有的应用特点等。第二节本章主要介绍模式生物斑马鱼的起源、发展、自身特点,以及在不同领域的应用。并着重说明斑马鱼在中医药领域中的应用现状,特别是在中药毒性研究方面所具有的特色,为本研究工作提供了依据。第二章“藻戟遂芫俱战草,”各反药组合样品制备基于响应曲面分析药物相互作用的样品制备要求,将海藻-甘草、大戟-甘草、甘遂-甘草及芫花-甘草分别按 15 组配比(1:150、1:67、1:39、1:25、1:17、1:11、1:6、1:4、1:2.8、1:1.8、1:1.2、1:0.84、1:0.6、1:0.36、1:0.2)进行水提液样品制备;甘遂-甘草按8组配比(1:6、1:2.8、1:1.8、1:1.2、1:0.84、1:0.6、1:0.36、1:0.2)进行先醇提后水提液样品制备。总共得到样品68份。第三章基于斑马鱼的甘遂-甘草反药组合急性毒性及相互作用研究第一节甘遂不同提取物对斑马鱼急性毒性的初步观察采用回流提取方法制备甘遂水提物、醇提物、先醇提后水提物;将甘遂不同提取物按几何级数设置浓度梯度,添加到斑马鱼只生活的水中,观察给药后96 h斑马鱼的死亡情况,以此为判断待测药物毒性大小的依据,采用SPSS13.0软件计算各药物对斑马鱼的半数致死浓度(LC50)。发现甘遂先醇提后水提物急性毒性最强,醇提物毒性其次,水提物毒性最弱,为进一步认识与评价甘遂的毒性作用提供了依据。第二节甘遂-甘草反药组合水提单煎混合液急性毒性及相互作用研究甘遂与甘草分别用水单独煎煮后,然后按照15个不同比例混合形成合并液。并将甘遂-甘草按递增梯度设置10组不同浓度,添加到斑马鱼生活的水中,观察给药后96h斑马鱼的死亡情况,统计各组死亡率,按照响应曲面分析法绘制曲面。结果显示:甘遂-甘草比例在1:20～2:1、甘遂浓度在31～62 μg/mL及甘草浓度在471.5～9430 μg/mL范围时呈现协同作用;甘遂-甘草比例在1:3～8:1、甘遂浓度在31～248 μg/mL及甘草浓度在471.5～1414.5μg/mL范围时呈现拮抗作用;而在其它量比范围内协同作用与拮抗作用均不明显。选择具有代表协同、相加、拮抗作用的配比点进行实验,结果甘遂-甘草协同作用与拮抗作用均得到有效验证。由此得出,甘遂-甘草分煎合并液在不同量比条件下药物相互作用的性质与程度都有不同。第三节甘遂-甘草反药组合先醇提后水提液急性毒性及相互作用研究基于甘遂在临床应用时常用散剂,故将甘遂与甘草按8个不同比例合并后先用95%甲醇提取,再用水提取,最后挥至无醇味,合并提取液以模拟散剂用药。并将甘遂-甘草按递增梯度设置8组不同浓度组,添加到斑马鱼生活的水中,观察给药后96 h斑马鱼的死亡情况,统计各组死亡率。结果发现斑马鱼没有表现出明显的相互作用。第四节甘遂-甘草反药组合水提合煎液急性毒性相互作用甘遂与甘草按15个不同比例混合后用水煎煮,形成合煎液。并将甘遂-甘草按递增梯度设置10组不同浓度,添加到斑马鱼生活的水中,观察给药后96 h斑马鱼的死亡情况,统计各组死亡率,按照响应曲面分析法绘制曲面。结果显示,大多数比例呈现出协同作用,尤其是当甘遂-甘草比例在1:30～2:1、甘遂浓度在31～93 μg/mL及甘草浓度范围在471.5～943 μg/mL时这一条带最为明显;甘遂-甘草比例在1:12～2:3、甘遂浓度在434～651 μg/mL及甘草浓度在943～4715 μg/mL范围时呈现拮抗作用;而在其它比例与范围内协同作用与拮抗作用均不明显。选择具有代表协同、相加、拮抗作用的配比点进行实验,其结果均得到有效验证。因此得出,甘遂-甘草合煎液在不同配比条件下致毒增毒程度有明显不同。第五节甘遂-甘草相互作用代表性组合对斑马鱼体内组织器官的影响采用回流提取方法分别制备甘遂-甘草反药组合水提合煎液最具有协同、相加及拮抗作用的三组配比,添加到鱼只生活的水中,每隔24h取出活泼的2只鱼,进行病理切片研究。发现甘遂-甘草反药组合水提合煎液主要是对斑马鱼体内消化器官产生损伤,而且随着时间的延长损伤程度加重;其中协同组损伤最为严重,相加组其次,拮抗组损伤最为轻微。斑马鱼的死亡原因可能是甘遂-甘草反药组合配伍使用后加剧了对其体内消化器官的影响,为进一步认识与评价甘遂-甘草反药组合配伍后使用的毒性作用提供了依据。第六节基于UPLC-TOF-MS的甘遂-甘草相互作用代表性组合差异性成分研究采用UPLC-TOF MS对甘遂-甘草反药组合中代表协同、拮抗组水提合煎混合液与水提单煎液所含化学成分进行差异性成分分析,对所建立的化学指纹信息采用正交偏最小二乘判别分析法(OPLS-DA),分析其导致毒性程度加大的指标性化学成分。发现至少14个潜在化学组分能够显著区分甘遂-甘草协同、拮抗作用组水提合煎混合液与水提单煎液,其中有4个出现在水提合煎液中的化学组分在水提单煎混合液中未出现,1个组分在水提单煎混合液中出现的在水提合煎液中没有出现。实验表明这些配伍前后的差异性化学成分有可能是导致甘遂-甘草反药组合毒性增强的原因。第四章基于斑马鱼的海蓬-甘草反药组合水提合煎液急性毒性及相互作用研究海藻与甘草按15个不同比例混合后用水煎煮成合煎液。并将海藻-甘草按递增梯度设置8组不同浓度,添加到斑马鱼生活的水中,观察给药后96 h斑马鱼的死亡情况,统计各组死亡率,按照响应曲面分析法绘制曲面。结果显示,海藻-甘草比例在1:1354～1:60、海藻浓度在3.134～6.268 mg/mL及甘草浓度在9.43～94.3 mg/mL范围时呈现协同作用;呈现拮抗作用范围较大,海藻-甘草比例在1:16～1:3、海藻浓度在6.268～31.34mg/mL及甘草浓度在0～94.3 mg/mL范围时呈现拮抗作用;而在其它量比范围内协同作用与拮抗作用均不明显。第五章基于斑马鱼的大戟-甘草反药组合水提合煎液急性毒性及相互作用研究大戟与甘草饮片15个不同比例混合后用水煎煮,形成合煎液。并将大戟-甘草按递增梯度设置8组不同浓度组,添加到斑马鱼生活的水中,观察给药后96 h斑马鱼的死亡情况,统计各组死亡率,按照响应曲面分析法绘制曲面。结果显示,在大戟-甘草比例在1:123～1:9、大戟浓度在0～0.54 mg/mL及甘草浓度范围在4.7～66.0 mg/mL时这一条带范围协同作用最为显著;呈现拮抗作用的范围占绝大多数,大戟-甘草比例范围在1:23～1:10、大戟浓度在0～188.0mg/mL及甘草浓度范围在0～1650.3 mg/mL呈现出拮抗作用;在其它比例与浓度范围协同作用与拮抗作用均不明显。第六章基于斑马鱼的芜花-甘草反药组合水提合煎液急性毒性及相互作用研究芫花与甘草饮片15个不同比例混合后用水煎煮,形成合煎液。并将芫花-甘草按递增梯度设置8组不同浓度组,添加到斑马鱼生活的水中,观察给药后96 h斑马鱼的死亡情况,统计各组死亡率,按照响应曲面分析法绘制曲面。结果显示,呈现出协同作用的范围较大,尤其在芫花-甘草比例在1:380～1:38、芫花浓度在0～98μg/mL、甘草浓度在3.78～37.8 mg/mL这一条带范围协同作用最为显著;而当芫花-甘草比例在1:3～5:8、芫花浓度在294～784 μg/mL及甘草浓度在471.5～2357.5 μg/mL时这一条带范围拮抗作用较为明显;而在其它比例与浓度范围内协同作用与拮抗作用均不明显。结论:本论文建立了基于斑马鱼的毒性快速评价体系,定量评价了中药“十八反”中“藻戟遂芫俱战草”4组反药组合药物相互作用,发现每组药物不同量比相互作用的性质与程度明显不同,并且都具有明显的协同增毒量比范围。比较来看,协同增毒量比范围最大的是芫花-甘草组,其次是大戟,最小是甘遂。对于斑马鱼,其毒性靶器官主要表现为消化系统。说明“藻戟遂芫俱战草”4组反药组合都具有“反”的特征,其中芫花-甘草组“相反”特征最为明显。本研究结果为确切回答“藻戟遂芫”与甘草配伍反与不反及其致毒/增毒特点提供了科学依据。本论文的特色和创新点为:1.采用模式生物斑马鱼作为实验动物来研究中药配伍的急性毒性及相互作用研究,为斑马鱼在中医药现代研究方面的应用提供了参考;2.采用响应曲面分析法来设计与研究二味药配伍使用后药物相互作用的性质与程度,为相关研究提供了思路与方法等方面的借鉴。