背景与目的:尽管近40年来自血病的治疗取得了极大的进展,但白血病耐药、残留、难治、复发仍是目前治疗的巨大障碍和亟待解决的难题,因此,很有必要进一步深入研究白血病细胞耐药的生物学背景。传统的耐药研究采用的是单细胞培养模型,不能很好地模拟肿瘤的生长状态及肿瘤微环境,目前认为肿瘤细胞与周围微环境的粘附作用参与其耐药的产生,血液系统肿瘤微环境即骨髓微环境,骨髓微环境介导耐药已成为目前血液学研究的热点之一。骨髓微环境的异常贯穿白血病的发生、发展全过程,同时,它也可为白血病细胞提供一个保护性微环境,使之免于药物的杀伤而导致治疗后体内白血病细胞残留、耐药、复发。但白血病细胞与骨髓微环境间相互作用的分子机制目前尚未彻底阐述清楚。近年来研究发现,主要介导细胞与细胞外基质间及细胞与细胞间的相互作用的细胞粘附分子一整合素与恶性肿瘤的发生发展密切相关,它通过介导肿瘤细胞与微环境基质、肿瘤与宿主细胞粘附及信号转导等多个环节作用,对肿瘤的发生、发展、侵袭、转移、耐药等过程产生影响。细胞的相互接触粘附可导致细胞生物学行为明显改变和对治疗反应的显著不同。最近研究证实,白血病细胞经整合素介导粘附后可明显增强细胞对化疗及放疗的抵抗性。目前认为,整合素分子是肿瘤靶向治疗的候选靶点之一。本课题组在前期工作发现,整合素分子及局部粘附激酶(FAK)的表达异常与CML疾病进展相关,同时,作为整合素分子及局部粘附激酶下游调控分子之一的小G蛋白Rho表达水平也与CML疾病进展相关,而在耐伊马替尼K562细胞上也是高表达的。进一步在耐伊马替尼K562细胞下调RhoA表达后发现细胞耐药性减弱,细胞凋亡增加,细胞表面粘附分子整合素表达增加。提示整合素、FAK、Rho与CML疾病进展、伊马替耐药密切相关,但三者间确切的相互作用需进一步实验研究。目前认为BCR/ABL融合蛋白ABL激酶区点突变是慢性髓系白血病细胞伊马替尼耐药的主要机制,但我们通过巢式PCR及直接测序在本研究前期诱导的耐伊马替尼K562细胞系中并没有发现ABL激酶区点突变,提示本课题实验中的K562细胞伊马替尼耐药形成另有不同的机制。以往研究表明,FAK、Rho都是细胞整合素分子信号传导通路下游重要的激酶。因此我们推测,在慢性體系白血病细胞疾病进展过程中,整合素、FAK、Rho表达异常,以及它们构成上下游逐级调控的信号通路,最终导致细胞的粘附性状发生改变,可能是非突变致细胞耐药形成的机制之一。因此,为了更好模拟白血病微环境,本实验通过构建纤维连接蛋白与白血病细胞共培养模型,探讨骨髓微环境细胞外基质主要成分纤维连接蛋白对伊马替尼处理K562细胞敏感性的影响,并进一步应用抗整合素分子单抗功能拮抗实验,初步探讨整合素蛋白活化前后对下游FAK、Rho蛋白活性的调控关系,以明确ingtegrin/FAK/Rho在参与白血病细胞粘附诱导耐药过程中的意义。研究方案:1.伊马替尼不同剂量以及不同作用时间处理K562细胞后,MTT法检测各组OD值,计算、比较各组的细胞增殖抑制率,确定伊马替尼对K562白血病细胞的最佳处理条件。2.K562细胞分别接种纤维连接蛋白包被组(Fn)、胶原蛋白包被组(Co)、悬浮培养对照组(mask),MTT法检测各组OD值,计算Fn组、Co组粘附率,确定适宜的细胞接种密度。3.伊马替尼不同剂量以及不同作用时间处理K562细胞后,MTT法检测Fn、Co、mask各组OD值,计算、比较各组的细胞增殖抑制率,探讨Fn粘附共培养在伊马替尼抑制K562细胞增殖中的保护效应。4.不同剂量的伊马替尼作用Fn、Co、mask各组K562细胞48小时后,用流式细胞仪通过AnnexinV-FITC/PI定量分析、比较各组细胞凋亡率的差异,探讨Fn粘附共培养对伊马替尼诱导K562细胞凋亡的影响。5.不同剂量的伊马替尼作用Fn、Co、mask各组CML原代骨髓单个核细胞,在不同作用时间采用MTT法检测各组的OD值,计算、比较各组的细胞增殖抑制率,探讨Fn粘附共培养在伊马替尼抑制CML病人骨髓单个核细胞增殖中的保护效应。6.K562细胞与Fn粘附共培养后,在不同的时间Pull down-Wersten Blot检测细胞内Rho-GTP含量的改变,并进一步比较Fn、Co、mask各组使用抗整合素分子单抗前后K562细胞p-FAK、Rho-GTP含量变化的差异,初步探讨整合素蛋白活化前后对下游FAK、Rho蛋白活性的调控关系。7.统计学方法:探讨实验干预因素的最佳处理条件实验、各实验组间细胞增殖抑制实验及凋亡实验结果采用析因方差分析,如经统计检测无显著交互效应,则退化为two-wayANOVA分析。Fn、Co组间粘附率测定及Western Blot实验采用单因素方差分析。使用SPSS13.0软件进行数据处理、统计分析。结果:1.实验干预因素最佳处理条件的确定。分别予0.1μM、0.4μM、0.8μM、1.6μM、3.2μM、6.4μM不同浓度的伊马替尼作用K562细胞Oh、24h、48h、72h后,比较不同浓度、不同时间细胞增殖抑制率的差异,结果显示,伊马替尼不同剂量水平(F=117.592,P=0.000)、药物不同作用时间(F=194.981,P=0.000)对细胞的生长抑制均有显著差异。2.细胞粘附率的测定。K562细胞接种于Fn、Co、mask各组,24h后MTT法测3组平均OD值分别为0.53±0.14、0.61±0.17、1.03±0.20,组间总体比较有显著差异(F=21.643,P=0.000),多重分析表明,Fn与mask、Co与mask比较均有显著差异,但mask与Co比较无显著差异,提示Fn和Co两者对K562细胞均有一定的粘附能力,而两者水平相当。计算Fn、Co的粘附率(粘附培养与悬浮培养的平均OD比值)分别为51.16%、59.11%。3.比较伊马替尼不同作用时间内各实验组间细胞增殖抑制的差异。K562细胞接种于Fn、Co、mask各组,药物作用24h、48h、72h后MTT法测定、计算各组细胞增殖抑制率,结果发现在3个观察时间点各组细胞增殖抑制率总体比较均存在显著差异(P值分别为0.006、0.000、0.000),各观察时间点内多重分析总体比较发现,Fn与mask、Fn与Co比较均有显著差异,但mask与Co比较无显著差异;各观察时间点内不同药物浓度对细胞的增殖抑制比较均有显著差异(P=0.000)。提示Fn粘附培养可一定程度上减弱伊马替尼对K562细胞的增殖抑制。4.比较伊马替尼不同剂量水平内各实验组间细胞凋亡率的差异。K562细胞接种于Fn、Co、mask各组,0.8μM、1.6μM伊马替尼作用48h后流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI定量分析细胞凋亡率,0.8μM剂量水平各组细胞总凋亡率(%)分别为16.24±3.47、26.05±3.44、30.55±6.43(F=7.378,P=0.024):1.6μM剂量水平各组细胞总凋亡率(%)分别为35.33±1.63、48.91±3.72、55.26±6.3 1(F=16.528,P=0.004);两剂量水平内各组多重分析结果相似,Fn与mask、Co与mask比较均有显著差异,但mask与Co比较无显著差异,提示Fn粘附共培养可增强K562细胞对伊马替尼诱导细胞凋亡的抵抗。5.比较伊马替尼不同作用时间内各实验组间CML原代骨髓单个核细胞增殖抑制的差异。CML原代骨髓单个核细胞接种于Fn、Co、mask,药物作用24h、48h、72h后MTT法测定、计算各组细胞增殖抑制率,结果发现在3个观察时间点各组细胞增殖抑制率总体比较均存在显著差异(P值均为0.000),各观察时间点内多重分析总体比较发现,Fn与mask、Fn与Co比较均有显著差异,但mask与Co比较无显著差异;各观察时间点内不同药物浓度对细胞的增殖抑制比较均有显著差异(P=0.000)。提示Fn粘附培养可一定程度上减弱伊马替尼对CML原代骨髓单个核细胞的增殖抑制。6.Fn粘附共培养后K562细胞Rho-GTP含量随时间变化的改变。细胞接种Fn包被的培养板,分别于培养Oh、24h、48h、72h收集细胞,Pull down-Wersternblot检测Rho-GTP与GAPDH含量比值分别为0.4546±0.0179、0.8729±0.0614、0.8654±0.0905、0.8362±0.0101(F=13.230,P=0.002),多重分析发现,共培养0h与24h、48h、72h比较均有显著差异,而粘附共培养24h、48h、72h间两两比较均无显著差异。7.Fn粘附共培养后K562细胞p-FAK、Rho-GTP含量的改变。细胞分别接种于Fn、mask、Co、Fn+抗CD29、mask+抗CD29、Co+抗CD29,培养24h后收集细胞,Pull down-Werstern blot检测p-FAK与GAPDH含量,各组含量比值分别为1.4067±0.2463、0.7971±0.1283、0.9724±0.2713、1.0236±0.1274、0.2266±0.0241、0.5610±0.0437(F=17.588,P=0.000):各组Rho-GTP与GAPDH含量比值分别为1.0513±0.3920、0.3500±0.0624、0.5174±0.1099、0.7579±0.2109、0.3277±0.1006、0.4246±0.0625(F=6.280,P=0.004);各实验组间p-FAK、Rho-GTP含量的变化有显著差异,多重分析发现,Fn与mask、Fn与Co比较p-FAK、Rho-GTP含量有显著差异(P＜0.05),而mask与Co比较无显著差异,Fn粘附共培养后细胞p-FAK、Rho-GTP表达量增加,Fn组使用抗CD29单抗后p-FAK含量显著降低(P＜0.05),而Rho-GTP含量比较无显著差异。结论:1.与Co粘附培养相比较,无论是K562细胞株细胞,还是CML患者骨髓单个核细胞,Fn粘附共培养均可明显减弱伊马替尼诱导的细胞增殖抑制及细胞凋亡,提示特异性接触粘附可能是细胞形成耐药原因之一。2.Fn与细胞特异性接触粘附共培养减弱伊马替尼诱导的细胞增殖抑制及细胞凋亡效应可能与Rho-GTP活性增强相关;应用抗CD29单抗可显著降低细胞内p-FAK含量,但并不能显著降低细胞内Rho-GTP含量,提示抗CD29单抗不能完全阻断K562细胞表面整合素分子与Fn的有效结合或细胞内另有通路活化Rho蛋白。