【摘 要】
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目的基于重组酶聚合酶扩增（RPA）技术结合侧向流动条带（LFS）技术建立一种牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）的现场快速检测方法,并从特异性、灵敏度、可行性等方面评估已建立的RPA-LFS检测方法。方法RPA作为一种新的核酸扩增方法,与包被胶体金的LFS可视化方法相结合,被开发用于快速检测P.gingivalis。以P.gingivalis标准菌株（ATCC 33277）的16S r RN
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目的基于重组酶聚合酶扩增（RPA）技术结合侧向流动条带（LFS）技术建立一种牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）的现场快速检测方法,并从特异性、灵敏度、可行性等方面评估已建立的RPA-LFS检测方法。方法RPA作为一种新的核酸扩增方法,与包被胶体金的LFS可视化方法相结合,被开发用于快速检测P.gingivalis。以P.gingivalis标准菌株（ATCC 33277）的16S r RNA序列作为RPA分析的靶标进行引物和探针的设计,并通过在引物和探针序列之间引入特定的碱基错配消除引物-探针二聚体造成的假阳性信号,最终筛选出一组特异性的引物探针组合来扩增目标序列。在25℃-48℃的温度下,反应5-40 min来进行反应条件的优化以确定最佳的反应温度和时间。对20株P.gingivalis的临床分离株及20株其它常见病原菌进行RPA-LFS检测,验证该方法的特异性。以10倍梯度稀释的P.gingivalis基因组DNA检测RPA-LFS方法的灵敏度,再通过Probit概率回归分析确定RPA-LFS法的最低检测下限,通过加入人类基因组DNA以检测该系统灵敏度能否抵抗人类基因组的干扰。最后,将RPA-LFS方法与PCR方法同时应用于130例慢性牙周炎患者的龈下菌斑标本的检测,以验证RPA-LFS方法的可行性。结果本研究以P.gingivalis标准菌株（ATCC 33277）的16S r RNA基因序列为模板,进行引物与探针的设计筛选以及碱基错配后,获得一组最佳引物-探针组合#2F/m R/m P2,最终建立了一套P.gingivalis的RPA-LFS标准检测方法。优化条件下的RPA反应在37℃恒温下仅需25min即可完成扩增,并且在不需要特殊设备的情况下,LFS就可以直观地检测到扩增产物。建立的RPA-LFS方法能够特异、准确地检测出20株P.gingivalis的临床分离株,同时也能将P.gingivalis与其他病原菌区分开来。该方法具有较高的灵敏度,最低检测下限为9.27 CFU/μL,且此灵敏度不受人类基因组DNA的影响。在130例慢性牙周炎患者的龈下菌斑标本的检测中,RPA-LFS法检测出118例阳性,12例阴性,检测结果与常规PCR一致,符合率为100%,但与常规PCR相比,RPA-LFS法反应时间更短。结论本研究基于RPA-LFS技术建立了一种快速、特异、灵敏、准确的P.gingivalis现场检测方法。该方法有助于简化P.gingivalis的以往检测方法的繁琐工作流程,且不依赖实验室设备,既可以满足椅旁诊断的需要,又能实现大规模的现场检测,对于口腔疾病和相关的系统性疾病的早期诊断和临床干预有重要指导意义。
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