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第一部分Egfl7在喉癌组织中的表达测定及临床意义
目的:探讨Egfl7(Egf-likedomain7)在喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中的表达及意义。
方法:采用RT-PCR和Western-blot方法检测33例新鲜喉癌组织和配对的癌旁非癌喉组织(NCLT)中Egfl7mRNA和Egfl7蛋白的表达;采用免疫组化方法检测116例喉癌组织中Egfl7蛋白的表达;采用Cox多因素回归法,结合临床随访资料和临床病理资料分析,研究Egfl7的表达与临床病理特征和预后的关系。
结果:
1.33例新鲜喉癌标本中,LSCC组织中Egfl7mRNA的阳性表达率87.9%(29/33)显著高于NCLT的阳性表达率33.3%(11/33)(P<0.01)。LSCC组织中Egfl7mRNA的平均表达水平也明显高于NCLT(1.42±0.21/0.86±0.11,P=0.008)。同一批样本中LSCC中Egfl7蛋白的阳性表达率90.9%(30/33)显著高于NCLT阳性表达率27.3%(9/33)(P<0.01)。Egfl7蛋白在LSCC组织中的平均表达水平也明显高于NCLT组织(0.97±0.21/0.41±0.13,P=0.001)。且Egfl7mRNA和Egfl7蛋白表达具有显著相关性(R=0.786,P<0.01)。Egfl7mRNA和Egfl7蛋白的表达水平与LSCC的临床分期、肿瘤的直径大小及有无淋巴结转移等临床病理特征明显相关(P<0.05)。Egfl7mRNA和Egfl7蛋白的表达水平和MVD呈正相关性(R=0.842,P=0.231)。
2.Egfl7蛋白阳性表达绝大多数位于细胞浆内。在116例LSCC组织中Egfl7蛋白阳性表达率为81.03%(94/116),Egfl7蛋白阴性表达率为18.97%(22/116)。
3.Egfl7蛋白表达与LSCC的临床分期(P=0.003)、肿瘤的直径大小(P=0.001)及有无淋巴结转移(P=0.002)明显相关。Egfl7蛋白在喉癌组织中的表达水平与患者性别、年龄、癌灶原发部位无关(P>0.05)。116例喉癌中Egfl7++/+++组67例,Egfl7-/+组49例,患者平均生存时间为36.9月,中位生存时间为43.2月。116例中55例在5年内死亡,在死亡病例中40例为Egfl7++/+++组,15例为Egfl7-/+组,两组之间具有显著性差异(P=0.007),Egfl7++/+++组喉癌患者手术后生存率低于Egfl7-/+组。采用Cox多因素回归分析,结果发现Egfl7蛋白表达(RR,1.74;P=0.012),淋巴结转移(RR,1.52;P=0.015)是喉鳞癌预后的独立预测因子。
结论:
1.Egfl7可能参与了喉癌的发生发展;
2.Egfl7蛋白可能成为预测喉癌的不良预后的肿瘤标志物。
第二部分RNAi干扰Egfl7对喉癌细胞肿瘤生物学行为影响的体内外研究
目的:探讨靶向沉默Egfl7的表达对LSCC侵袭转移的作用机制。
方法:构建pSUPER.Retro.neo逆转录病毒小RNA干扰质粒,转染PT67包装细胞,获得病毒颗粒并瞬时二重感染Hep-2喉癌细胞系,干预沉默Hep-2中Egfl7的表达,体外采用划痕实验、Transwell侵袭实验、MTT和流式细胞仪检测等方法,研究喉癌细胞株Hep-2分泌Egfl7调控喉癌细胞分化增殖、喉癌侵袭运动的分子机制。体内采用裸鼠成瘤实验研究体内抑制Egfl7的表达对喉癌细胞成瘤能力的影响。
结果:
1.本研究成功构建了靶向Egfl7的siRNA质粒和对照组表达质粒。
2.获得了稳定表达序列1和序列C的Hep-2细胞系,分别命名为Hep-2Egfl7RNAi+和Hep-2Egfl7RNAi-。
3.Westernblot结果显示:Hep-2Egfl7RNAi+中Egfl7的表达被明显抑制。
4.体外实验中抑制Egfl7的表达可以抑制喉癌细胞的侵袭迁移。
5.体外实验中抑制Egfl7的表达不影响喉癌细胞的增殖和凋亡。
6.体内裸鼠成瘤实验结果:体内抑制Egfl7的表达可以抑制喉癌细胞的成瘤能力。
比较MiceEgfl7RNAi+和MiceEgfl7RNAi-两组裸鼠模型中Hep-2原发瘤的大小:皮下种植45天后Hep-2原发瘤的大小(cm3)分别为3.01±0.22和3.45+0.23,差异具有显著性意义(P<0.05)。
结论:
1.Egfl7在喉癌侵袭转移中发挥关键性作用;
2.Egfl7可能成为抗喉癌侵袭转移的基因治疗新靶点。
第三部分Egfl7调控喉癌新生血管生成的体内外研究
目的:探讨靶向沉默Egfl7的表达对LSCC血管生成的作用机制。
方法:干预沉默人微血管内皮细胞系(HMEC-1)中Egfl7表达,体外采用划痕实验、Transwell侵袭实验、二维和三维血管成管实验、MTT和流式细胞仪等方法检测,研究喉癌细胞株Hep-2分泌Egfl7调控喉癌细胞分化增殖、喉癌侵袭运动和喉癌血管成管的分子机制,体内采用三维共培养的细胞接种裸鼠成瘤实验验证Egfl7调控喉癌血管成管的分子机制导致肿瘤生物学行为的改变。
结果:
1.逆转录病毒介导的小RNA干扰特异性沉默HMEC-1人微血管内皮细胞系中Egfl7的表达。感染HMEC-1的效率为80%~90%。Westernblot检测结果:实验组HMEC-1Egfl7RNAi+较对照组HMEC-1Egfl7RNAi-Egfl7蛋白表达明显下降,分别为0.36±0.07和0.86±0.02(P<0.05),这提示成功地抑制了HMEC-1细胞中Egfl7的表达。
2.体外实验中抑制Egfl7的表达可以抑制人微血管内皮细胞(HMEC-1)的迁移。
3.体外实验中抑制Egfl7的表达不影响人微血管内皮细胞(HMEC-1)的增殖和凋亡。
4.体外实验中抑制Egfl7的表达可以抑制人微血管内皮细胞(HMEC-1)的血管生成。
5.体内实验中抑制Egfl7的表达可以抑制VEGF诱导的血管生成。
结论:
1.Egfl7可能通过调控血管成管分子机制参与了喉癌的侵袭转移;
2.Egfl7可能成为抗喉癌血管生成的基因治疗新靶点。