研究背景:宫颈癌是世界范围内常见的女性恶性肿瘤,每年有超过50万的新增病例,其中超过26万的患者死于宫颈癌。宫颈癌的发生和发展是一个复杂的生物学过程,涉及多种因素和步骤。目前已经证明,高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV),如 HPV16、18、33、52 和 58 型等,是其主要的致病因素。其中,HPV16、18是最常见最致癌的高危型HPV,导致超过75%的子宫颈癌病例。高危型HPV E6和E7基因的不受控表达,在功能上相当于p53和pRb基因突变,会导致细胞永生化、遗传不稳定、遗传突变的积累以及由此产生的恶性转化。E6和E7癌蛋白在被感染的宫颈上皮细胞中的表达所导致的细胞生物学功能的改变以及涉及到的具体的分子机制一直是科研人员研究的热点。干扰素诱导蛋白 16(Interferon-inducible protein16,IFI16)是 HIN-200(The Interferon(IFN)-inducible p200-protern)家族成员之一。IFI16 蛋白具有家族成员共有的结构基序,N末端的PYRIN结构域(PYRIN domain,PYD)以及C末端包含两个相对保守的约200个氨基酸的HIN结构域。PYD常见于细胞死亡相关蛋白,如热蛋白(PYRIN),凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase),也被称为PAAD/DAPIN结构域,已发现在IFI16的N末端存在PYD,表明IFI16可能在细胞凋亡调控过程中发挥关键作用。IFI16蛋白中的PYD是同型蛋白质-蛋白质相互作用的结构域,其允许IFI16与其他蛋白的相互作用,包括BRCAI、pRb、p53、E2F以及NF-K B等。HIN结构域含有两个联系的寡核苷酸/寡糖结合折叠(Oligonucleotide/oligosaccharide-binding folds,OB-folds),其允许IFI16结合单链或双链DNA。此外,在HIN结构域还含有pRb结合区域和p53结合区域。与其他家族成员相比,IFI16具有更加广泛的功能:1)IFI16可以作为双链DNA感受器,引起针对某些病原体或破碎细胞的免疫反应;2)参与损伤组织或肿瘤形成过程中的血管形成;3)作为促炎蛋白,在自身免疫系统疾病中发挥作用;4)参与细胞增殖、细胞凋亡、细胞衰老和细胞周期的调控。与此同时,IFI16与癌症发生相关的证据也正在积累。目前,已经发现了 IFI16在肝细胞癌、头颈部肿瘤、乳腺癌和口腔鳞状细胞癌等9种人类实体瘤中的作用;然而很少有研究报道IFI16与宫颈癌以及HPV感染的相关性。有研究表明,IFI16在乳腺癌中表达下调,其表达还与头颈部鳞状细胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)的等级呈显著负相关,并与HNSCC的生长、凋亡、血管生成和炎症密切相关。另外有研究表明,前列腺上皮细胞中IFI16基因的组蛋白去乙酰酶依赖性转录沉默有利于前列腺癌的发展。与IFI16在乳腺癌、HNSCC和前列腺癌中的抑癌作用相反,有研究人员在睾丸癌和化学抗性上皮卵巢癌组织中发现了 IFI16蛋白的表达明显上调,但目前并没有相关的功能和机制研究。此外,IFI16与p53之间的相互作用也持续得到研究人员的关注。有研究表明,IFI16可以在DNA损伤、电离辐射或者氧化应激等状态下激活p53的表达,影响p53下游靶蛋白的表达以及p53介导的细胞凋亡和周期调控,从而影响肿瘤的发生和发展。目前已经明确,高危型HPV E6蛋白主要通过影响p53的表达,调控p53介导的细胞周期和细胞凋亡,从而诱导宫颈癌的发生。有研究表明,在与E6配合的复合物中,细胞泛素连接酶E6-associated protei n(E6AP)靶向p53,对其进行泛素化和降解,从而导致HPV诱导的宫颈癌。E6以一种未知的机制作为E6AP强有力的激活剂发挥功能。尽管有研究表示E6AP的LxxLL基序可以与E6结合,引起构象变化,使E6能够与p53结合,但人们对肪蛋白与p53之间具体的作用机制仍然不甚清楚。第一部分:IFI16在宫颈癌组织中的表达水平及意义研究目的:研究IFI16在宫颈癌组织和其他肿瘤中的表达水平及其与临床病理特征的相关性分析。研究方法:1.使用GEPIA在线工具分析基于TCGA和GTEx数据库中9,736个肿瘤和8,587个正常样本的RNA测序表达数据,分析IFI16在泛肿瘤中的表达水平以及和预后的关系。检索PUBMED数据库中IFI16在各肿瘤中的研究现状。2.免疫组化检测:使用宫颈癌组织芯片进行免疫组织化学检测,检测宫颈癌和癌旁组织中IFI16的表达水平,以及IFI16的表达与各种临床病理特征的相关性。研究结果:1.GEPIA分析结果显示,在数据库的31种肿瘤中,IFI16在胆癌(CHOL)等11种肿瘤中表达上调,在嫌色细胞癌(KICH)等4种肿瘤中表达下调。生存分析发现,在肾透明细胞癌(KIRC),肾乳头状细胞瘤(KIRP),低级胶质瘤(LGG)中,IFI16低表达的患者预后好(P<0.05),同时我们发现在数据库提供的31种肿瘤数据中,IFI16在宫颈癌(CESC)中表达水平最高。2.在PUBMED中,我们检索了 IFI16肿瘤研究相关的文献,检索结果显示,IFI16与多种肿瘤发生相关。体外实验中,IFI16在前列腺细胞和甲状腺髓样癌细胞,乳腺癌,头颈鳞状癌细胞中发挥抑癌基因的作用,在淋巴瘤、Wilms肾细胞癌及肝细胞癌中IFI16的过表达会促进肿瘤细胞的增殖,而对于IFI16在宫颈癌中的研究仍少有报道。3.免疫组化结果显示,在宫颈癌组织中,IFI16的阳性表达率为67.7%,而在癌旁组织中,IFI16的阳性表达率仅为12.9%,有显著差异(p<0.01)。进一步的病理特征分析统计结果显示,IFI16的表达水平与肿瘤的大小和患者的年龄无明显统计学相关性(p>0.05),但是与肿瘤分化程度相关。在低分化肿瘤组织中,IFI16的表达明显高于中分化肿瘤组织,差异具有统计学意义(p<0.05)。研究结论:在TCGA和GTEx数据库中,IFI16在11种肿瘤中表达上调,在4种肿瘤中表达下调。所有肿瘤中,IFI16在宫颈癌中表达最高。文献检索显示IFI16与多种肿瘤发生密切相关,而在宫颈癌中尚少有报道。IFI16在宫颈癌组织中较癌旁组织高表达,且表达水平与肿瘤分化程度密切相关,在低分化肿瘤组织中呈高表达趋势。第二部分:HPV18 E6E7通过下调IFI16的表达影响人宫颈上皮永生化细胞(H8细胞)的生物学功能研究目的:构建过表达HPV-ME7蛋白的H8稳转株细胞,并探究HPV E6/E7通过抑制IFI16的表达影响H8细胞生物学功能。研究方法:1 从pcDNA3.1-HPV18-E6 和 pcDNA3.1-HPV18-E7质粒中分别扩增出 HPV18 E6和E7基因,将E6,E7基因经重叠PCR(OVERLAP PCR)扩增连接后再克隆到穿梭质粒pLVX-mCMV-ZsGreenl-Puro上,以空载体为对照,使用重组质粒进行慢病毒包装。慢病毒感染H8细胞后使用嘌呤霉素筛选H8-E6E7稳转株细胞,利用荧光观察以及PCR检测两种方法鉴定稳转株。2利用CCK8实验、克隆形成实验、Transwell实验和细胞凋亡实验,检测E6E7表达对细胞增殖、克隆形成能力、迁移、侵袭和细胞凋亡的影响,3利用western blot实验检测H8细胞中HPV-E6E7的过表达对IFI16蛋白表达的影响。4分别在野生型(WT)H8细胞和H8-E6E7细胞中上调IFI16的表达,利用CCK8实验和克隆形成实验检测过表达IFI6对两种细胞增殖的影响,利用流式细胞仪和western blot检测过表达IFI16对细胞凋亡的影响,探究HPV-E6E7是否通过调控IFI16的表达来影响H8细胞的生物学功能。研究结果:1.通过荧光观察以及PCR检测,成功的筛选出稳定表达HPV-E6E7蛋白的H8稳转株细胞。2.CCK8实验结果显示,H8-E6E7细胞的增殖速率明显高于对照组H8-WT细胞。在培养72h后,H8-E6E7细胞的OD值显著高于H8-WT细胞的OD值(P<0.05)。细胞克隆实验结果显示,H8-E6E7细胞的克隆形成数目和克隆大小明显高于对照组 H8-WT 细胞(K0.05)。3 Transwell实验检测发现,在相同时间内,H8-E6E7细胞完成迁移和侵袭的细胞数目都明显高于对照组H8-WT细胞。统计分析结果表明,H8-WT细胞完成迁移的细胞数目为63±4个,完成侵袭的细胞数目为73±6个;而H8-E6E7细胞完成迁移的细胞数目为140±14个,完成侵袭的细胞数目为168±13个;两者的差异具有统计学意义(P<0.05)。4流式细胞仪检测结果表明E6E7的过表达抑制了 H8细胞的凋亡。对照组H8-WT细胞的凋亡比例为7.65%±0.95%,而H8-E6E7细胞的凋亡比例显著降低,仅为 1.86%±0.33%(P<0.05)。western blot 的实验结果显示,H8 细胞中 E6E7的过表达能够促进抗凋亡蛋白Bcl2的表达,同时会抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase-3 的表达。5.H8细胞中HPV E6E7的过表达下调了细胞内IFI16的表达。H8-WT细胞中IFI16 mRNA的表达水平显著高于H8-E6E7细胞(p<0.01),是H8-E6E7细胞中IFI16 mRNA表达水平的20倍以上。蛋白表达趋势与mRNA表达趋势一致:H8-WT细胞中IFI16的蛋白表达水平显著高于H8-E6E7细胞(p<0.01),是H8-E6E7细胞中IFI16蛋白表达水平的5倍左右。6.CCK8实验结果表明,IFI16的过表达能够抑制H8细胞的增殖。同时,过表达IFI16能够部分抵消E6E7蛋白表达对细胞增殖的促进作用,四个实验分组中,细胞的增殖速率为:H8-E6E7>H8-E6E7+IFI16>H8-WT>H8-WT+IFI16,实验结果差异显著,具有统计学意义(K0.05)。克隆形成实验中,各组实验结果与CCK8实验结果一致,四组细胞的克隆形成数目为:H8-E6E7>H8-E6E7+IFI16>H8-WT>H8-WT+IFI16,结果差异具有统计学意义(P<0.05)。7.IFI16的过表达能够影响细胞内凋亡相关蛋白的表达。H8细胞中过表达IFI16抑制了凋亡抑制蛋白Bcl2的表达,上调了促凋亡蛋白Bax和Caspase3的表达。在E6E7过表达的H8细胞中,上调IFI16的表达能够减弱E6E7引起的抗凋亡作用。研究结论:在H8细胞中,过表达E6E7后,能够促进细胞的增殖和克隆形成能力,细胞的转移能力增强,同时细胞的抗凋亡能力增加,E6E7蛋白的过表达使永生化的宫颈上皮细胞获得了肿瘤细胞的特性。E6E7的上调会抑制IFI16mRNA和蛋白的表达。H8细胞中IFI16的上调会减弱E6E7引起的促细胞增殖和抗凋亡能力,IFI16起到抑癌基因的作用。第三部分:IFI16参与调控H8细胞内p53的表达研究目的:通过研究H8细胞中IFI16与抑癌基因p53之间的关系,探究IFI16参与调控H8细胞增殖和凋亡的分子机制。研究方法:1.使用蛋白结合预测工具STRING在线预测IFI16的结合蛋白,挑选p53蛋白进行后续验证。2.将pcDNA3.1-IH16-FLAG和pcDNA3.1TP53-HIS质粒共转染到H8细胞中,48h后收集细胞总蛋白,进行蛋白免疫共沉淀实验,检测IFI16和p53蛋白的结合。3.分别在H8细胞和H8 E6E7细胞中过表达IFI16基因,Westernblot检测IFI16过表达后对p53蛋白表达量的影响。4.在H8细胞中过表达IFI16,分别在实验组和对照组中加入放线菌酮,抑制新蛋白的合成,分别在0,1,2,4,6h收集蛋白,Westernblot检测p53的表达,探究IFI16的表达对p53蛋白稳定性的影响。研究结果:1.免疫共沉淀实验结果显示,在H8细胞中过表达的IFI16和p53蛋白能够互相结合。2.Westernblot实验结果显示,在H8细胞中,过表达E6E7能够降低p53蛋白的表达(p<0.05);上调IFI16后,两组细胞中p53的蛋白表达量均上升(p<0.05)。3.蛋白降解实验结果显示,IFI16过表达组中P53蛋白的降解速率较对照组明显减慢,说明IFI16的表达有利于P53蛋白的稳定性。研究结论:在宫颈上皮H8细胞中,IFI16可以上调p53的表达,E6和E7蛋白可能通过抑制IFI16表达来降低p53水平发挥促癌作用。IFI16可以与H8细胞内的P53蛋白相结合,维持P53蛋白的稳定性,增加细胞内P53蛋白的积累,可能通过此途径来发挥抑癌作用。研究意义:本研究首先通过免疫组化方法发现IFI16在宫颈癌组织中较癌旁组织高表达,且表达水平与肿瘤分化程度相关。然后通过慢病毒感染的方法成功构建了 HPV-E6E7稳定高表达的H8细胞株,使细胞的增殖,转移,抗凋亡能力增强,使细胞具有了肿瘤细胞的特性。后续实验结果证明了 E6E7的过表达会抑制IFI16mRNA和蛋白的表达,而H8细胞中IFI16的上调会减弱E6E7引起的促细胞增殖和抗凋亡能力,表明IFI16起到了抑癌基因的作用;这种作用可能是通过和抑癌基因P53蛋白结合,增加其稳定性而实现的,而HPV-E6E7的促癌作用可能是通过下调IFI16-P53蛋白的表达来实现的。本研究中我们发现了 IFI16与HPV感染、宫颈上皮细胞癌变和p53表达之间的相关性,探索了高危型HPV在宫颈癌发生中可能具备的新的分子机制,为宫颈癌的防治提供了新的思路和理论途径。