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牙周炎是常见的人类口腔疾病之一，牙周袋形成和牙槽骨吸收是其主要的临床体征和病理改变。业已肯定，牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)是各种牙周炎、尤其是慢性牙周炎(chronic periodontitis，CP)病变区或活动部位最主要的病原菌。尽管已有不少文献报道，牙龈卟啉单胞菌内毒素(LPS)、菌毛、胶原酶等均是该菌的重要致病因子，但其致病机制仍未完全了解。 胶原是牙周组织的重要成分，其中Ⅰ型胶原约占牙周韧带中胶原含量的80％。Pg具有胶原酶，因而与牙周组织破坏及牙周炎进展有密切关系。Kato(1992)等人首次报道了Pg ATCC 53977株胶原酶基因prtC的核苷酸及氨基酸序列，该基因全长1002 bp，编码333 aa组成的分子量约为38 kDa的多肽。prtC基因表达产物能降解Ⅰ型胶原，但与真核生物的胶原酶无结构相似性。根据血清学分类，Pg菌株有a、b、c三个主要血清型，但所有菌株中均存在prtC基因。Wittstock等(1996，2000)先后报告，PrtC有较强的抗原性，约85％牙周炎患者血清中可出现以IgA为主的PrtC抗体；6个Pg临床菌株的prtC基因核苷酸序列相似性高达98％以上，提示该基因有较高的保守性。 菌毛在细菌致病过程中的重要作用已被人们所公认，Pg也具有能粘附牙周上皮细胞的菌毛。Hongo等(1999)发现，Pg外膜蛋白A(Porphyromonas gingivalis outer membrane protein A，PgmA)的功能与菌毛的形成有关，若该基因缺失，菌毛蛋白合成受阻；pgmA基因在细菌基因组DNA中紧邻菌毛蛋白亚单位结构基因fimA的上游，全长1473 bp，编码分子量约60 kDa的外膜蛋白。浙江大学硕士学位论文 众所周知，Pg是专性厌氧菌，营养要求高，生长周期长，常规的临床病原分离培养和表型鉴定程序较为烦琐、费时，且阳性率不高。由于牙周炎的高发病率，有人提出采用牙周炎主要病原菌的表面蛋白抗原制备的多价基因工程疫苗进行牙周炎预防和控制。此外，Pg胶原酶在牙周炎发生和发展过程的作用也未完全明了。因此，我们从Pg基因组DNA中克隆了prtC、pgrnA基因，构建其表达系统，建立表达产物提纯方法，探讨了PrtC在牙周组织破坏中的作用，并为进一步研制Pg免疫诊断试剂盒及Pg基因工程疫苗奠定基础。 目的:构建PgprtC和pgrnA基因原核表达系统并鉴定表达产物的免疫反应性和抗原性，了解慢性牙周炎患者牙周组织破坏程度与馥下菌斑标本中PrtC水平之间的关系。 方法:常规酚一氯仿法提取Pg ATcc 33277和47A一1株基因组DNA，采用高保真PCR扩增全长prtC和pgmA基因，T一A克隆后测定核昔酸序列。采用pET32a质粒构建prtC和pg叮A基因原核表达载体，在E. coli BLZ 1 DE3宿主菌中用不同浓度的IpTG诱导目的重组蛋白rPrtC和rP脚A的表达，用Ni.NTA亲和层析法提纯rPrtC和rP脚A。分别采用以兔抗Pg全菌血清和兔抗融合蛋白血清为一抗的westem blot鉴定表达产物的免疫反应性和抗原性。收集209例慢性牙周炎患者眼下菌斑标本，建立EUSA检测标本中PrtC水平，并分析其与牙周组织破坏程度的关系。 幼.:1 .PCR 从上述菌株基因组DNA中扩增出prtC和pg叮A目的片段，其大小分别约为1005bP和1473 bp。2.核昔酸和氨基酸序列分析结果 所克隆的PgATCC 33277和47A一1株prtC基因、pg口A基因的核昔酸序列完全相同。与GeneBank中登录的相应序列比较，所克隆的PrtC基因核昔酸和氨基酸序列相似性分别为98.46洲卜.99.79%和98.77%~100%，pgrnA基因核昔酸和氨基酸序列相似性分别高达98.90%和99.17%。3.表达载体的鉴定 所构建的表达载体pET32a-prtC和pET32a-pgrnA经双酶切和琼脂糖凝胶电泳后，在预期位置上可见目的条带，核昔酸序列测定结果证实了插入的目的基因序列和方 浙江大学硕士学位论文向正确。4．表达产物的提纯和鉴定 SDS－PAGE结果表明，l刀、0．5、0．1、0刀5 nunow IPTG均能有效地诱导rPrtC和 rPgha的表达。表达产物均主要以包涵体形式存在，其产量均约占全菌蛋白的50％。5·Western bolt检测结果 兔抗 Pg全菌抗血清能分别与 rPrtC和 rPgha结合，rPrtC和 rPgha免疫家兔也能产生相应抗体。6．ELISA检测结果 叨．39o／o的 CP龈下菌斑标本（191／209）PrtC检测结果阳性。轻、中和重度 CP标本 OD。90值的均值土 SD分别为 0．44土 0．15、0．45土 0．17、0．49土 0．22，其中重度 CP标本＊N＿值高于轻度（P＜0刀5），但轻度与中度、中度与重度之间的＊＊＿值无明显差异（P＞0刀5）。讨治与问相：1．我们克隆的PgprtC、pgha基因核苦酸和氨基酸序列与GeneBank中相应序列的相似性高达98％以上，所构建的pET32a－prtC－EColiBLZIDE3、pET32a－pghaEcoliBLZIDE3在IPTG剂量低至0＊5 nnnow时也能很好地表达htC和 rPgha，其表达t高达细菌总蛋白的 50％左右，表明本研究成功地构建了 PgprtC和pgha基因高效原核表达系统。2．Western blot结果证实，rPrtC、rPgha可诱导家兔产生特异性抗体