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毛细管电泳(CE)由于其高效、快速、进样量小、操作简单、且对蛋白质,DNA和RNA等生物大分子的分离分析具有显著的优势,使其很快成为分析化学领域的前沿课题之一。但在pH>3.0条件下,由于未处理毛细管内表面硅羟基的电离形成带负电的吸附点,使管壁对生物大分子,尤其是碱性蛋白质产生强烈的吸附,导致分离峰拖尾,峰形展宽,分离效率下降,吸附严重时导致分离失败。毛细管电泳涂层柱技术是解决毛细管内壁吸附的有效方法。目前,涂层材料主要采用传统的线性高分子聚合物,但线性聚合物存在黏度大,易堵塞毛细管柱,分离柱效低,且稳定性差等缺点,从而使其无法满足毛细管电泳涂层柱在实际应用中的要求。
本论文设计合成了分子内部含有大量醚键,分子末端为大量活性羟基的超支化聚3-甲基-3-羟甲基氧杂环丁烷(HPMHO),并对其三维网状立体分子结构进行了表征分析。创新性的将这种超支化聚醚用作毛细管电泳柱涂层材料,分别制备了新型的物理吸附涂层柱和化学键合涂层柱,考察了涂层柱的电渗流,对碱性蛋白质的分离能力,缓冲溶液pH值的适用范围,以及涂层柱的稳定性能,取得了满意的结果。
本研究工作的内容主要包括以下几个方面:
(1)超支化聚醚的合成:实验选择3-甲基-3-羟甲基氧杂环丁烷(MHO)作为增长单体,以三氟化硼乙醚络合物作为引发剂,通过优化合成反应的条件,利用阳离子开环聚合的方法成功地合成了以三羟甲基丙烷为中心核G2,G3,G4超支化聚醚,以及支化度(DB)分别为0.21,0.37,0.43的超支化聚醚。
(2)超支化聚醚的表征:通过IR,13CNMR,元素分析,羟值测定证明所合成超支化聚醚为分子末端含有大量羟基,内部为大量醚键的三维空间近似球状的分子结构,通过粘度测定表明合成产物具有良好的溶解性和较低的粘度,通过TG-DTA分析证明了合成产物具有良好的耐热性能。
(3)超支化聚醚物理吸附涂层柱的制备及评价:先用1mol/L的氢氧化钠溶液对毛细管内壁进行预处理,然后分别将G2,G3,G4,DB为0.21,0.37,0.43超支化聚醚的10%(M/M)甲醇溶液在一定压力下通入毛细管内,制备物理吸附涂层毛细管电泳柱,并考察了其性能。实验结果表明,涂层柱能够有效地降低电渗流,抑制蛋白质在毛细管内的吸附;在pH3.0-6.0较宽的范围内对碱性蛋白质实现较高的分离柱效;且涂层柱性能稳定、重现性好、使用寿命长,分离柱效和分离度随着超支化聚醚代数和支化度的增加而增大。其中,G4涂层柱和DB0.43涂层柱对溶菌酶的分离柱效分别达到了1.9×106plates/m和1.1×106plates/m。
(4)超支化聚醚化学键合涂层柱的制备及评价:在三氟化硼乙醚络合物存在条件下,通过硅烷化偶联剂γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(γ-GPTMS)分别将合成的DB为0.21、0.37和0.43超支化聚醚键合到毛细管柱内壁,制备了化学键合型涂层柱,并对其性能进行了考察。实验结果表明,化学键合涂层柱同样能够在pH3.0-6.0范围内对碱性蛋白质实现有效的分离;能够有效地降低电渗流,抑制蛋白质在毛细管内表面的吸附。分离柱效和分离度随支化度的增加先增大后减小,支化度为0.37的化学键合涂层柱对蛋白质的分离效果最好,且具有良好的稳定性能,重现性好,使用寿命长。
(5)通过综合比较物理吸附涂层柱和化学键合涂层柱性能,发现超支化聚醚物理吸附涂层柱制备方法简便,对碱性蛋白质的分离效果好,成本低,且同样具有较好的稳定性能。因此,具有更广阔的应用领域和更好的推广价值。