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亮氨酸脱氢酶(LeuDH,EC 1.4.1.9)是一种广泛存在于生物体内并参与多种支链氨基酸合成的酶。能可逆催化L-型氨基酸氧化脱氨基合成α-酮酸。利用亮氨酸脱氢酶还原氨化α-酮酸合成非蛋白源氨基酸得到了广泛的研究和开发,如L-叔亮氨酸和L-正缬氨酸的合成等;而利用亮氨酸脱氢酶氧化脱氨基L-氨基酸合成α-酮酸的研究较少,其产物α-酮酸可以用于饲料、食品添加剂、药物和化学品的合成过程,并在人类健康方面具有重要的作用。本研究以来源于短小芽孢杆(Exiguobacterium siricum255-15)亮氨酸脱氢酶(简写为EDH)为研究材料,通过对EDH的定向进化,筛选高酶活的EDH突变株,应用于亮氨酸脱氢酶生物合成α-酮酸应用。本论文的主要研究内容如下:1、构建表达质粒pET28a-EDH,并转化到大肠杆菌BL21中,得到高效表达的重组菌株BL21(pET28a-EDH),对目标蛋白纯化后,对EDH酶学性质进行研究,结果表明对于转氨和脱氨反应,亮氨酸脱氢酶催化反应的最适pH同为9.5、最适温度分别为45℃和50℃,且在还原胺化反应方向上,具有更好的pH稳定性。分别对亮氨酸脱氢酶的转氨和脱氨反应的动力学参数进行测定,脱氨反应中亮氨酸脱氢酶对NAD~+和L-亮氨酸的Km值为0.656和0.762mM,说明其亲和性良好。而转氨反应中亮氨酸脱氢酶对NADH及TMP(三甲基丙酮酸)Vmax较大,分别为333.3和55.6 μmol/(min·mg),说明其在催化TMP合成L-叔亮氨酸方向具有巨大潜力。通过对亮氨酸脱氢酶的催化底物谱测定,结果发现亮氨酸脱氢酶对L-型氨基酸就有较为广泛的底物谱,但对D-型氨基酸没有催化活性,且D-型氨基酸会抑制其活性。当在亮氨酸脱氢酶催化L-亮氨酸时,添加同等浓度的D-亮氨酸,其酶活性降低近50%。2、建立了一个简单可行的适用于亮氨酸脱氢酶的高通量筛选方法。即在诱导突变菌体表达酶蛋白的同时,在培养基中添加甘氨酸和tritonx-100,使重组细胞快速裂解释放目标蛋白,便于突变酶的活性检测和筛选,通过本实验建立的筛选方法对1055个EDH突变子进行筛选,筛选到一株EDH突变子K172R,对L-亮氨酸的催化活性为14.15 U/mg,较野生型酶活性提高了 45.9%,对底物L-亮氨酸和辅酶NAD~+的与野生型的Km值分别为0.313和0.5 mM,与野生型酶相比具有更高的亲和性。将突变子K172R应用于催化L-亮氨酸脱氨基反应合成α-酮异己酸反应,构建了 EDH偶联乳酸脱氢酶(LDH)作为辅酶再生循环的双酶体系用于α-酮异己酸的合成,经过初步催化实验,反应24h后,突变子K172R催化L-亮氨酸得到产物α-酮异己酸的产量为7.22 mM,较野生型EDH的催化合成产量提高了 29.02%。3、构建EDH和葡萄糖脱氢酶(GDH)双酶偶联反应体系,并对催化合成L-叔亮氨酸反应条件进行了优化。结果发现最优的底物TMP和葡萄糖的摩尔比为1:2,最佳的反应温度和pH分别为30℃和pH 10.0。在此条件下反应7h,底物转化率达到100%,产物L-叔亮氨酸浓度达到100 mM,其光学纯度大于99%(e.e.%)。与双菌体系相比,双质粒系统使用更低的菌体浓度,达到更高的反应效率,生产过程更为简单。