PVY(马铃薯Y病毒)最早由Smith于1931年在马铃薯上首次发现,目前世界各地均有报道,此病毒引起烟草、马铃薯、辣椒等多种作物病害。PVY在烟草上引起的病害又称“脉带病”,“脉坏死病”等,在世界各烟区均有发生,在我国也广泛存在。PVY近年在我国烟草上的发生和危害呈急剧上升趋势。如何防治与解决PVY病毒病已经是当前烟草生产面临的重要问题。抗病育种是重要的手段之一。人们通过常规育种育成了大量的抗性品种,但存在抗性基因与不良农艺性状连锁等问题。后来生物技术的兴起为解决这些问题提供了一条可能的途径。源于同种病毒的不同基因介导的转基因品种大规模种植时,它们之间的相互杂交就可能使其后代含有两种或两种以上的病毒基因,从而导致抗病性的丧失。还有就是可能产生有毒蛋白,对人体产生危害。而本研究是将植物源的抗病基因转化到烟草中,既能提高植物抗病性,又能解决转病原物来源基因所引起的生物安全问题,具有很好的发展前景。 pvr2基因被认为是辣椒中的一个抗PVY基因,而近来研究证明这个基因就是eif4E基因一个等位基因。eif4E-pvr2基因表达的产物与PVY的vpg蛋白相互作用,从而影响PVY的自我复制,减少了PVY病毒的聚集量,起到了明显减轻发病症状的作用。2002年Ruffel等从野生辣椒品种Yolo Y中克隆到了eif4E-pvr2基因,并转化到了感病品种Yolo wonder中,对PVY产生了一定的抗性。 本实验根据GenBank中发表的eif4E CDS序列,设计PCR扩增引物,通过RT-PCR的方法从辣椒的叶片中克隆得到689bp大小的感病eif4E基因片段。根据GenBank上发表的eif4E-pvr2基因的CDS序列,将其与感病eif4E基因进行序列比对,序列比对结果表明,这两个基因的序列绝大部分是相同的,只有在200bp和236bp处的两个碱基不同,eif4E-pvr2基因为A和G,而eif4E基因都是T。根据这两个基因的序列特点,我们用点突变的方法克隆到了eif4E-pvr2基因。构建了eif4E基因和eif4E-pvr2基因的植物表达载体pEIF2301和pMEIF2301,用农杆菌介导法将eif4E基因和eif4E-pvr2基因转入烟草K326中,分别获得卡那霉素抗性植株10株和12株。通过GUS检测和PCR的方法鉴定,最终各筛选出4株阳性植株,说明eif4E基因和eif4E-pvr2已经整合到烟草基因组中。