采用cDNA基因微阵列技术，五人份胃癌与相对应正常胃粘膜mRNA反转录为探针，与含有18000个分别来自正常肝库、肝癌库、肾上腺库、垂体库、下丘脑、DC库的基因点阵，以及1200个肿瘤相关基因点阵的Microarray尼龙膜杂交。经计算机平行化分析，筛选到67个胃癌下调基因，其中包括抑癌基因，凋亡相关基因，DNA复制、转录、翻译相关基因，细胞周期相关基因，细胞迁移相关基因，免疫相关基因，神经生长因子及其受体家族基因等。揭示了胃癌的发生发展，是多基因、多过程、多阶段异常的结果，它们共同作用导致胃癌的发生、发展与转移。 采用抑制消减杂交技术，建立五人份正常胃粘膜mRNA(Tester)抑制消减杂交胃癌mRNA(Driver)的差异表达cDNA文库，用PCR及差异表达克隆菌转膜反向杂交判定其消减效率。随机挑选反向杂交阳性克隆测序，寻找胃癌下调新基因。结果证实该文库具有特异性高、假阳性率低、克隆低丰度差异基因高度灵敏的突出优点。克隆到两个低丰度mRNA表达的胃癌下调新基因片段，命名为GDDZ与GDDR。分别均经半定量RT-PCR证实为胃癌下调新基因。GDDZ、GDDR经cDNA末端快速扩增，长度分别延至802bp、751bp，得到了GDDR的全长基因。GDDZ与GDDR均被国际GenBank收录，收录号：AF494508(GDDZ)，AF494509(GDDR)。胃癌下调全长新基因GDDR， 第四早匠大学协 文 中文拈耍 其编码蛋白与候选抑癌基因 CAll编码蛋白为同源蛋白，GDDR及 GDDZ可 能在胃癌的发生发展及转移中具有重要意义。 从己成功建立的五人份正常胃粘膜mRNA抑制消减杂交胃癌mRNA的 差异表达文库，随机挑取阳性克隆测序为 CA，O旺读框 600hP，编码 199 个氨基酸。CAll 为一刚刚发现的新基因，性质功能都不知道。网上功能提 示可能为一分泌肽。Northern blot、RT－PCR证实其为胃癌下调基因。在其它 13种组织器官中扩增此基因双在胃组织中有表达。地高辛标记 CA 11 原位 mRNA杂交，结果显示CAll位于胃粘膜卜皮细胞。将CAll克隆至带有Myc 检测标签，以及m 纯化标签的真核表达载体pCDNA3．l／MyC－H以－八。瞬时 转染 CAll的 COS－7细胞，生长至对数生长期时吸取培养液，Talon金属亲 和树脂吸附、洗脱后洗脱液SDS－PAGE蛋白电泳，用抗C－MyC标签的一抗行 做＊＊inN ＊1，结果未检狈到＊Al互帅＊融合蛋白表达条带：＊All 转染＊OS－7 细胞后加抗C－MyC标签的一抗，最后加 FITC标记的二抗，荧光显微镜下观 察其融合表达蛋白位于细胞浆。最后在CAll稳定转染胃癌7901细胞系中， 用抗 C－MyC标签的一抗细胞免疫组化染色，终于抓住了 CA 11－MyC融合表达 蛋白从胞浆到穿膜，至分泌到细胞间隙的整个过程。首次证实 CAll基因编 码蛋白是一分泌肽。 CAll稳定转染胃癌细胞系7901，经RT－PCR、Western blot及CAll融 合蛋白表达的细胞水平观察，均证实 CA被稳定转染入胃癌细胞并表达。 生长曲线表明转染 CAll细胞较转染空载质粒 PCDNA3．l恤yC－HIS卜）A生长明 显抑制；MTT检测结果显示转染CAll胃癌细胞系79m A值呈显著下降趋 势，即较转染空载质粒pCDNA3．IMyC－H此一A胃癌细胞系7901生长缓慢 （72h，0．379上0．019 A VS 0．467士0刀ZIA，P＜0＊1）。裸鼠荷瘤实验亦表明，CAll 能显著抑制胃癌细胞的生长。形态学观察可见，较对照组空载转染 790细胞， CAll稳定转染胃癌 7901细胞系形态不规则，核糖体、胞膜纤毛明显减少。 — —4一 第四军医大学俗士论文 中文幻县 转染 CAll的胃癌 7901细胞较对照组空载转染 7901细胞，GI期增多而 S期 减少。CAll与多种己知抑癌基因、癌基因并无相互调节的关系。CAll稳定 转染肝癌 HepGZ细胞系，对其生长无明显影响。这些结果均提示，CA能 明显抑制胃癌细胞的生长，使肿瘤的表型发生变化。CA 很可能为一具有 胃组织特异性、功能强大的抑癌候选基因，其机制是通过影响胃癌细胞民 至 S期的转化发挥作用。CAll可能不是一作用广泛的候选抑癌基因。为寻 找与 CAll相互作用。结合蛋白，揭示 CAll抑癌作用的通路，成功构建了 C川 l酵母双杂交诱饵 PGBKT7载体。