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目的：
研究鼻咽癌细胞株经去甲基化药物5-杂氮-2-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine，5-aza-CdR)处理后，其脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase，Syk)启动子甲基化水平的变化情况，以及鼻咽癌细胞株Syk基因mRNA、蛋白表达及鼻咽癌5-8F细胞侵袭和转移的变化情况。
方法：
1、细胞培养与药物处理
选择高分化鼻咽癌细胞株CNE-1、低分化鼻咽癌细胞株CNE-2、低分化成瘤高转移鼻咽癌细胞5-8F和永生化非癌性人鼻咽上皮细胞株NP-69进行细胞培养。待细胞贴壁后在培养液中加入5-aza-CdR，经5-aza-CdR处理后的细胞株作为处理组，未经5-aza-CdR处理的细胞株作为对照组。
2、重亚硫酸氢盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR，BS-PCR)检测Syk基因启动子甲基化状态
提取细胞总DNA，利用BS-PCR检测经5-aza-CdR处理前后CNE-1、CNE-2、5-8F和NP-69细胞的Syk启动子甲基化程度的变化情况。
3、实时荧光定量PCR(quantitative real time fluorescence polymerase chain reaction，Q-RT-PCR)检测Syk mRNA的表达
提取细胞总RNA，利用Q-RT-PCR检测5-aza-CdR对CNE-1、CNE-2、5-8F和NP-69细胞的Syk mRNA表达的影响。
4、Western blot检测Syk蛋白的表达
提取细胞蛋白，利用Western blot检测5-aza-CdR处理前后CNE-1、CNE-2、5-8F和NP-69细胞Syk蛋白表达的变化情况。
5、Transwell细胞体外侵袭和迁移实验检测5-8F细胞侵袭转移能力
利用Transwell实验检测经不用浓度5-aza-CdR处理后5-8F细胞的穿膜细胞数。
6、统计学分析
统计学分析采用SPSS17软件，计量资料以均数±标准差((x)±s)表示，P＜0.05为差异具有统计学意义。
结果：
1、5-aza-CdR处理前后CNE-1、CNE-2、5-8F和NP-69细胞的Syk启动子甲基化程度
对照组和处理组细胞的Syk基因启动子甲基化率CNE-1分别为31.2％±1.2％和16.8％±2.3％、CNE-2分别为52.8％±1.6％和36.4％±1.9％，5-8F分别为70.4％±2.2％和48.0％±1.9％，处理组细胞的Syk基因启动子甲基化率与对照组相比存在显著差异(P＜0.01)。而NP-69细胞Syk基因启动子的甲基化在5-aza-CdR处理前后均未检测到。
2、5-aza-CdR处理前后CNE-1、CNE-2、5-8F和NP-69细胞的Syk mRNA表达水平
对照组NP-69细胞的Syk mRNA的表达水平按100％计算，对照组CNE-1、CNE-2和5-8F细胞的Syk mRNA的表达量分别为50.0％±1.1％、32.3％±1.4％和28.5％±1.0％，处理组CNE-1、CNE-2、5-8F和NP-69细胞的Syk mRNA的表达量分别为75.8％±2.3％、42.0％±3.1％、36.6±1.5％和99.3％±2.1％。处理组细胞SykmRNA表达量与对照组相比显著提高(P＜0.05)，而在NP-69细胞株中Syk mRNA表达量在5-aza-CdR处理前后的变化无明显差异(P＞0.05)。另外，5-aza-CdR对提高高分化鼻咽癌细胞CNE-1的Syk mRNA表达的影响大于低分化鼻咽癌细胞CNE-2(P＜0.01)。
3、5-aza-CdR处理前后CNE-1、CNE-2、5-8F和NP-69细胞的Syk蛋白表达水平对照组NP-69、CNE-1、CNE-2和5-8F细胞的Syk蛋白的表达量分别为93.7％±2.1％、43.8％±1.8％、23.6％±2.3％和19.8±2.6％，处理组分别为93.5％±2.6％、65.5％±1.9％、36.2％±2.1％和32.7％±1.2％。NP-69细胞株处理组与对照组相比，Syk蛋白表达量无明显变化(P＞0.05)，三种鼻咽癌细胞处理组与各自对照组相比，Syk蛋白表达量显著提高(P＜0.01);5-aza-CdR对提高高分化鼻咽癌细胞CNE-1的Syk蛋白表达的影响大于低分化鼻咽癌细胞CNE-2(P＜0.01)。
4、5-aza-CdR处理前后5-8F细胞的穿膜细胞数
对照组侵袭细胞和转移细胞OD值分别为0.532±0.022和0.628±0.036，经不同浓度的5-aza-CdR处理24h后其侵袭细胞和转移细胞OD值，1μmol/L时分别为0.461±0.031和0.542±0.029;5μmol/L时分别为0.318±0.019和0.380±0.031;10μmol/L时分别为0.101±0.026和0.143±0.040。经5-aza-CdR处理后，5-8F细胞侵袭和转移能力均显著低于对照组(P＜0.01)，且5-aza-CdR对5-8F细胞侵袭和转移能力的抑制作用具有剂量依赖性。
结论：
1、经5-aza-CdR处理后CNE-1、CNE-2和5-8F鼻咽癌细胞株的Syk基因启动子甲基化水平降低，5-aza-CdR能有效逆转鼻咽癌细胞株Syk基因启动子的甲基化状态。
2、去甲基化处理使CNE-1、CNE-2和5-8F鼻咽癌细胞株因甲基化沉默的Syk基因恢复表达，Syk mRNA及蛋白表达升高，同时呈剂量依赖性地降低5-8F细胞的侵袭和转移能力。
3、低分化鼻咽癌细胞株CNE-2对5-aza-CdR敏感性低于高分化鼻咽癌细胞株CNE-1，经药物处理后，高分化的鼻咽癌细胞株恢复Syk基因表达的比率较低分化的鼻咽癌细胞株高。
4、5-aza-CdR在逆转鼻咽癌细胞Syk基因启动子甲基化恢复其表达的同时，其本身存在的细胞毒性对正常的鼻咽上皮细胞Syk基因的转录活性没有影响。