灰盖鬼伞[Coprinopsiscinerea(Schaeff.ex Fr.)S.F.Gray]是一种良好的研究担子菌生长机制的模式生物,虽食用价值有限,但它可以帮助我们了解其它类实验室难培植的食用、药用真菌等的生长发育和生殖机制。对指导食用菌的生产、提高食用菌产量具有重要的理论和实践意义。本实验室在前期的研究工作中以灰盖鬼伞菌柄顶端快速伸长区域为实验材料,利用植物细胞壁伸长仪,建立了检测真菌菌柄伸长特性的研究平台。利用该平台,本课题组对鬼伞菌柄细胞壁的伸长特性进行了研究探讨,初步揭示担子菌菌柄的伸长机制。同时,我们实验室还从灰盖鬼伞子实体伞盖抽提物中分离纯化到3个具有β-1,3-葡聚糖酶活性的蛋白,它们可以通过相互之间的协同作用,降解灰盖鬼伞细胞壁中的β-1,3-葡聚糖组分,帮助我们初步了解了担子菌细胞壁的水解机理。但是如需对此深入进行基因功能、分子生物学探究,就必须建立鬼伞遗传转化体系。因此,本论文在目前已有的理论及实验基础上,以模式真菌灰盖鬼伞为研究对象,构建了灰盖鬼伞遗传转化体系,并获阳性的转化突变菌株。本研究首先进行了灰盖鬼伞营养缺陷型菌株AmutBmut无性粉孢子的诱导、收集以及粉孢子原生质体制备条件的优化。在优化条件下,每个平板上可以收获的粉孢子109-1010个,萌发率60%-80%。以粉孢子为材料制备的原生质体,制备率达到了 70%左右,再生率达到了 15%左右。本文构建了一个含灰盖鬼伞对氨基苯甲酸合成酶基因(pab1)的营养缺陷型标记质粒pEASY-zero-pab1,作为筛选标记,利用PEG-CaC12介导的转化方法,通过PABA营养缺陷筛选,获得了阳性克隆。通过PCR扩增外源活性pab1基因片段和点圈实验证实,外源活性pab1基因片段已经成功整合到了灰盖鬼伞转化子菌株基因组中并能正常表达。在这一体系的基础上,构建了含双孢菇gpdII、灰盖鬼伞trp、bgl等不同启动子调控的绿色荧光蛋白标记质粒pCCGFP-Xpro-1与营养缺陷标记质粒pEASY-zero-pab1共转化AmutBmut菌株,获得了阳性克隆。其中,大约30%的营养缺陷筛选转化子为共转化子,且不同的启动子调控下绿色荧光蛋白基因的表达量存在差异。