牙髓碱性磷酸酶的提纯、cDNA克隆和氢氧化钙对其活性、表达的影响

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碱性磷酸酶(ALP)是较为肯定的参与钙化的酶类。牙髓组织富含ALP,其性质与肝/骨/肾型ALP相似。研究牙髓ALP的生化性质将有助于阐明牙髓、牙本质的钙化修复机制。 氢氧化钙制剂是目前临床首选的盖髓药物,它具有独特的促进牙髓、牙本质修复的作用,但其作用机制尚不清楚。最新研究表明:牙髓细胞具有创伤后转化为造牙本质细胞的性质,因此,研究氢氧化钙对牙髓细胞的合成代谢的作用,对于进一步了解氢氧化钙的作用机制具有一定的意义。 本文采用正丁醇抽提法和层析法提纯了狗牙髓ALP。对其性质研究表明:牙髓ALP的PAGE图谱为1条带,分子量约为129000;热稳定性较差;最适pH10.1;底物浓度为6mmol/L时反应达到饱和、Mg2+、Za2+强烈激活、Ca2+轻度激活、EDTA明显抑制ALP活性。牙髓ALP性质与肾ALP相似,属于L/B/K型ALP。 采用基因工程技术,研究细胞中基因表达情况,有助于从分子水平上了解药物的作用机理。从细胞全基因组文库中获得目的基因的工程量大,耗时耗力,且不现实。因此,我们以体外合成的大鼠L/B/K-ALP。cDNA的高保守性的ALP活性区的2段核苷酸序列为引物,采用反转录PCR和定序克隆获得大鼠L/B/K-ALP部分cDNA的分子克隆。酶切分析表明插入片段大小约为188bp,符合预期大小。 3H-TdR、3HUR掺入结果显示:0.055mmol/L氢氧化钙具有促进大鼠牙髓细胞DNA、RNA合成的作用。以光敏生物素标记的大鼠L/B/K-ALP
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