由葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)引起的葡萄霜霉病是葡萄生产中最重要的真菌病害之一。该病害发生普遍,危害严重,化学药剂一直是控制该病的最主要的措施。然而,由于化学农药长期大量持续应用,致使3R (Resistance-—抗药性,Residuce—残留,Resurgent—再猖獗)问题突出,同时造成环境污染和果品质量下降,因此寻找一种新的安全有效的控病途径成为当务之急。生物防治具有经济有效和环境友好的优势,己成为植物病害防治研究的热点。本文以分离自葡萄叶片上的细菌为研究对象,筛选出对葡萄霜霉病菌具有较强抑制作用的菌株,开展发酵条件优化和田间防效评价,并对控病机理进行深入探讨。以下是研究的主要内容。1.葡萄霜霉病生防细菌筛选及鉴定从辽宁省9个葡萄产区采集的叶片上分离到细菌303株,采用葡萄离体叶片法筛选出对葡萄霜霉病菌抑制活性较强的菌株SY286,防效达93.18%。该菌株对辣椒疫病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄白腐病菌、番茄晚疫病菌、苹果轮纹病菌、番茄红粉病菌等植物病原菌亦表现出较强的抑制活性。该菌株作为生防细菌具有一定的研究和应用潜力。通过SY286菌株的生理生化试验,结合分子生物学信息确定了其分类地位。SY286菌株革兰氏染色呈阴性,菌体杆状,接触酶、氧化酶、淀粉水解、硝酸盐还原反应等呈阳性；明胶液化、七叶苷水解、吲哚试验为阴性。其16S rDNA全序列共1385bp,与GenBank已知比对显示其与苍白杆菌的序列同源性达99%,初步鉴定为苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)。2.SY286菌株发酵条件优化通过单因子试验和正交试验,得到最适合SY286菌株产生抑菌活性物质的发酵条件。最佳条件为葡萄糖10g·L"1,牛肉膏7.5g·L-1,硝酸钾5g·L-1,氯化钠2.5g·L-1,250mL三角瓶的装液量为90mL,适宜接种量5%,摇床转速为150r·min-1,培养温度27℃,初始培养液的pH7.0,发酵培养72h。优化培养条件后SY286菌株产生抑菌物质能力明显增强,抑菌率提高了6.98%。3.SY286菌株作用机理及田间防效评价SY286菌株代谢产物对葡萄霜霉病菌具有很强的抑制作用。用SY286代谢产物粗提液处理葡萄霜霉病菌孢子囊及孢子梗,发现病菌孢子囊和孢囊梗均出现干瘪、褶皱、畸形和破裂现象。该菌株能产生纤维素酶、蛋白酶和嗜铁素等抑菌活性物质。2年田间试验表明SY286菌株对葡萄霜霉病防效较高,其发酵原液对葡萄霜霉病的中期防效可达90%以上,末期防效达80%以上,比52.5%抑快净2000倍液稍低,但是明显高于58%甲霜锰锌1000倍液。SY286菌株发酵液稀释400倍液末期防效与甲霜锰锌1000倍防效相当,可达到70%以上。该菌对葡萄植株安全。4.SY286菌株抑菌粗提蛋白性质分析SY286菌株抑菌物质为胞外次级代谢产物。经60%饱和度的硫酸铵盐析出的蛋白对葡萄霜霉病菌的抑制活性最强,抑菌率达到了81.98%。温度、酸碱度以及紫外线对抑菌粗提蛋白的活性均有一定影响。抑菌粗提蛋白在50℃以下和pH4-10范围内,抑菌活性相对稳定。抑菌粗提蛋白的抑菌活性受蛋白酶的影响较大,蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶均对其活性具有较大影响。5.SY286菌株纤维素酶基因的克隆与表达根据已报道的纤维素酶基因序列设计引物,经PCR扩增得到了561bp纤维素酶基因相关片段,根据此片段的序列设计特异性引物,通过Tail-PCR得到其上下游序列,经拼接获得完整的纤维素酶基因的ORF序列(命名为SY286基因)。SY286基因序列ORF长度为1494bp,以ATG为起始密码子,TAG为终止密码子, SY286基因编码一个含497个氨基酸的蛋白质,预测的蛋白分子量为55.04kDa,等电点PI为8.12。利用SDS-PAGE电泳对重组载体在E. coli BL21(DE3)中的表达结果进行检测。重组质粒在15℃、22℃、30℃、37℃,0.5mmol·L-1的IPTG诱导下,表达产物在PAGE凝胶上均出现特异性条带。扫描电镜观察结果显示,表达产物对葡萄霜霉病菌及孢子囊均有抑制作用,经处理后,其和孢子囊均出现不同程度的皱缩,破裂,而对照中葡萄霜霉病菌及孢子囊表面平滑,与SY286菌株代谢产物粗提物及纤维素酶处理现象基本一致。