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目的:观察制川乌对甲醛及完全弗式佐剂(Complete Freund’s adjuvant,CFA)致慢性炎症性疼痛小鼠的镇痛作用及特点,并从Kappa(K)阿片受体和瞬态电压感受器阳离子通道 V1(Transisient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)及炎症介质角度研究其镇痛作用机制。方法:首先采用甲醛致慢性炎症性疼痛小鼠模型,观察制川乌对该模型两个时相的舔足时间的影响,初步评价制川乌的镇痛作用及初步的中枢/外周机制定位,再采用CFA致慢性炎症性疼痛小鼠模型,运用机械刺激和热辐射刺激等行为学方法评价制川乌的镇痛作用特点和机制。机制研究中,选用CFA致慢性炎症性疼痛小鼠模型,运用μ、δ、κ拮抗剂、抗强啡肽免疫血清,采用机械刺激、热辐射刺激和热板刺激等行为学评价方法研究其镇痛效应与κ阿片受体及强啡肽的关系,同时,我们还采用了旋转实验和旷场实验来评价制川乌对动物运动行为的影响。为了解制川乌的镇痛作用与TRPV1的关系,体内研究分别选用CFA致慢性炎症性疼痛小鼠模型和辣椒素(TRPV1激动剂)致痛小鼠模型,采用伤害性刺激、机械刺激、热辐射刺激等行为学方法,比较TRPV1+/+和TRPV1-/-小鼠对制川乌镇痛作用的影响,同时进行体温测定评价制川乌给药前后对小鼠体温的影响。体外实验选用HEK293T细胞,构建TRPV1质粒,转染成HEK293T-TRPV1细胞,通过[Ca2+]成像技术评价制川乌对该细胞荧光强度的影响,同时,我们还采用了 MTT法评价制川乌对细胞增殖活性的影响。1.制川乌对甲醛致慢性炎症性疼痛小鼠的镇痛作用研究(1)取40只ICR雄性小鼠,随机分为5组,正常组,CFA组,制川乌组(0.68g/kg)3个时间点组,每组8只,给药组和正常组与模型组分别灌胃制川乌和双蒸水,模型组小鼠右后足底皮下注射甲醛溶液,制川乌组小鼠分别在灌胃给药30min、60min和90min足底皮下注射甲醛溶液,正常组小鼠右后足底皮下注射生理盐水,立即观察甲醛注射后60min的舔足情况。(2)取40只ICR雄性小鼠,随机分为5组,正常组,CFA组,制川乌组3个剂量(0.34g/kg、0.68g/kg、1.34g/kg)组,给药及造模方法同上,足底注射甲醛或生理盐水后观察65min的舔足时间。2.制川乌对CFA致慢性炎症性疼痛小鼠的镇痛作用研究取48只ICR雄性小鼠,随机分为6组,正常组,CFA组,正常+制川乌组(1.35g/kg),CFA+制川乌低、中、高剂量组(0.34g/kg,0.68g/kg,1.35g/kg),每组8只,模型组小鼠右后足底皮下注射CFA溶液,正常组小鼠右后足底皮下注射吐温-80溶液,48h后,给药组和正常组与模型组分别灌胃上述剂量的制川乌和双蒸水,连续灌胃7天,并进行机械和热辐射痛阈值测定。3.从阿片受体角度研究制川乌对CFA致慢性炎症性疼痛小鼠镇痛作用机制(1)取36只ICR雄性小鼠,随机分为6组,对照组,CFA组,制川乌组(1.35 g/kg),制川乌+选择性μ、κ、δ阿片受体拮抗剂组,制川乌+拮抗剂组先注射选择性μ、κ、δ受体拮抗剂,再给小鼠灌胃制川乌1.35g/kg,制川乌组和正常组及模型组分别灌胃制川乌1.35g/kg和双蒸水,1h后,再对各组小鼠机械痛阈值进行检测。并采用小鼠正常组,CFA组,制川乌组(1.35g/kg),制川乌+K受体拮抗剂组进行热辐射和热板痛阂值检测。(2)取24只ICR雄性小鼠,随机分为4组,正常组,CFA组,制川乌组(1.35g/kg),制川乌+抗强啡肽免疫血清组,将小鼠L5和L6脊椎间注射抗强啡肽免疫血清并立即灌胃制川乌1.35g/kg,其他各组给药情况同上,1h后,再检测各组小鼠的机械和热辐射痛阈值。(3)将小鼠分为制川乌组和正常对照组分别灌胃制川乌和双蒸水,1h后,将小鼠放在旋转仪上,记录小鼠在4min内掉下去的次数和第一次掉下去的潜伏时间。同时,我们也进行了旷场实验,给药1h后,将小鼠放在反应箱内底面中心,记录小鼠在5min内经过区域的总数和抬腿的次数。4.从TRPV1角度研究制川乌对CFA致慢性炎症性疼痛小鼠镇痛作用机制(1)取C57BL/6野生型小鼠(TRPV1+/+)及TRPV1基因敲除小鼠(TRPV1-/-)各24只,雄性并各分成3组,正常组、模型组、制川乌组(1.35g/kg)。并在给药前后比较各组的痛阈值。(2)取30只ICR小鼠,随机分为5组,即正常组,辣椒素组、AMG9810组、制川乌(1.35g/kg)组、制川乌(1.35g/kg)+κ受体拮抗剂组。各组分别给药后再将小鼠足底皮下注射辣椒素或吐温-80溶液,并立即放入透明的大烧杯中观察5min内小鼠的舔足时间,同时检测各组机械痛和热辐射痛阂值。(3)从人类基因组中获得的TRPV1的序列,并构建到TRPV1质粒中,通过脂质体2000将TRPV1质粒转染到人胚肾细胞(HEK293T)形成HEK293T-TRPV1细胞并用含钙的培养基培养及制川乌干预,将钙离子荧光探针Fluo-4AM(40μ)加入该细胞中,用辣椒素孵育,激光共聚焦显微镜检测。结果:1.制川乌对甲醛致慢性炎症性疼痛小鼠的镇痛作用与正常组比较,模型组显著升高了甲醛致慢性炎症性疼痛小鼠的两个时相的舔足时间(P<0.05);制川乌灌胃给药60min后对该模型两个时相的舔足时间降低作用最明显(P<0.05);并且制川乌剂量依赖性的降低了甲醛致慢性炎症性疼痛小鼠两个时相的舔足时间(P<0.05)。2.制川乌对CFA致慢性炎症性疼痛小鼠的镇痛作用与正常组比较,模型组显著降低了 CFA致慢性炎症性疼痛小鼠的机械和热辐射痛阈值(P<0.05);与模型组比较,制川乌各组剂量依赖性地提高了 CFA致慢性炎症性疼痛小鼠的机械和热辐射痛阈值(P<0.05),而给药1h的镇痛作用最强。给药一天和连续给药一周比较,相同剂量的制川乌对小鼠的痛阂值没有差异,提示给药剂量范围的制川乌无耐药性。3.阿片受体角度研究制川乌对CFA致慢性炎症性疼痛小鼠镇痛作用机制(1)μ、κ、δ受体拮抗剂对制川乌镇痛作用的影响:与正常组比较,模型组机械痛阂值明显降低(P<0.05);与模型组比较,制川乌组明显升高了小鼠的机械痛阂值(P<0.05);κ受体拮抗剂显著拮抗了制川乌对CFA致慢性炎症性疼痛小鼠机械痛阈值的升高作用(P<0.05),而μ、δ受体拮抗剂不影响制川乌对CFA致慢性炎症性疼痛小鼠机械痛阈值的升高作用。(2)κ受体拮抗剂对制川乌镇痛作用的影响:与正常组比较,模型组热辐射痛阈值明显降低(P<0.05);与模型组比较,制川乌组明显升高了小鼠的热辐射痛阂值(P<0.05),且κ受体拮抗剂部分拮抗了制川乌对CFA致慢性炎症性疼痛小鼠热辐射痛阂值的升高作用(P<0.05)。(3)抗强啡肽免疫血清对制川乌镇痛作用的影响:与正常组比较,模型组机械和热辐射痛阈值明显降低(P<0.05);与模型组比较,制川乌明显升高了小鼠的机械和热辐射痛阈值(P<0.05);而抗强啡肽免疫血清部分拮抗了制川乌对CFA致慢性炎症性疼痛小鼠机械痛阈值的升高作用(P<0.05),且其抑制率与上述的κ受体拮抗剂处理组相近,提示了制川乌的镇痛作用与强啡肽/κ阿片受体系统的活化相关。热板实验中,κ受体拮抗剂几乎完全拮抗了制川乌对CFA致慢性炎症性疼痛小鼠升高热板痛阂值的作用。提示了κ阿片受体活化参与了制川乌的主要中枢镇痛过程。(4)制川乌对小鼠运动行为的影响,旋转实验,与正常组相比,制川乌组小鼠从旋转仪第一次掉下的潜伏时间和掉下的次数都没有统计学差异;和旋转实验结果类似,旷场实验,与模型组相比,制川乌组小鼠穿过的方格总数和抬腿次数都没有统计学差异,提示了制川乌不影响小鼠的运动行为,说明制川乌没有中枢镇痛药物的镇静副作用。4.从TRPV1角度研究制川乌对CFA致慢性炎症性疼痛小鼠镇痛作用机制(1)制川乌对TRPV1+/+和TRPV1-/-小鼠机械痛阈值的影响:TRPV1+/+和TRPV1-/-小鼠的造模前后的基础机械痛阈值没有统计学差异,而TRPV1+/+和TRPV1-/-小鼠给予制川乌灌胃后,均显著降低了小鼠机械刺激痛阈值;与TRPV1+/+制川乌组比较,TRPV1-/-制川乌组在灌胃0.5h到1h时,小鼠机械刺激痛阈值的抑制率明显降低;该结果表明TRPV1参与了制川乌的镇痛作用过程。(2)κ受体拮抗剂对制川乌升高辣椒素致痛小鼠痛阈值的影响:与正常组比较,模型组的伤害性反应舔足时间明显增多(P<0.05),制川乌和阳性药AMG-9810显著降低了小鼠伤害性舔足时间(P<0.05),而κ受体拮抗剂明显拮抗制川乌对于小鼠舔足反应时间的降低作用;有关机械刺激和热辐射刺激实验,与正常组比较,模型组的机械和热辐射阂值明显降低(P<0.05),制川乌和阳性药AMG-9810显著提高了小鼠的机械和热辐射痛阂值(P<0.05),而κ受体拮抗剂部分拮抗了制川乌的镇痛作用。提示κ阿片受体部分参与了制川乌的镇痛过程,即除了κ阿片受体外还存在其他镇痛机制。与此同时,制川乌给药前后小鼠体温变化与正常组没有统计学差异,而AMG9810明显升高了小鼠的体温(P<0.05)。提示了制川乌不产生小鼠体温升高的副作用。(3)制川乌对辣椒素诱导HEK293T-TRPV1细胞钙离子浓度的影响:辣椒素明显增强了 HEK293T-TRPV1细胞内钙离子荧光强度和提高了阳性细胞的数量(P<0.05),而制川乌(0.25～1ug/ml)剂量依赖性的降低了 HEK293T-TRPV1细胞内钙离子浓度(P<0.05),而且MTT结果表明,制川乌组的细胞活性与正常组没有统计学差异。提示了制川乌的镇痛作用与TRPV1通道活化相关。结论:制川乌对甲醛和CFA致慢性炎症性疼痛小鼠具有镇痛作用,且无耐受性;制川乌的镇痛机制主要与活化中枢强啡肽/κ阿片受体系统和抑制外周TRPV1通道活性、降低外周炎性介质释放相关,同时,有效剂量的制川乌没有产生中枢类药物普遍存在的运动活性异常和TRPV1拮抗剂易引起的体温异常升高等副作用。该结果为制川乌的临床应用提供实验依据。