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目的:研究珠母贝糖胺聚糖对小鼠机体免疫功能的影响,并对其安全毒理学进行评价,为开发出具有增强免疫功能的珠母贝糖胺聚糖保健食品提供科学依据。
方法:
增强免疫功能实验方法:(1)采用免疫器官指数法和碳廓清实验,检测珠母贝糖胺聚糖粗品(CPG)对正常和免疫低下小鼠脏器指数及单核-吞噬细胞吞噬能力的影响。(2)采用MTT法体外检测CPG及PG-1、PG-2(CPG经DEAE-52-纤维素柱层析纯化级分)直接和协同ConA对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。(3)采用比色法检测CPG对正常和免疫低下小鼠抗体生成细胞数和血清溶血素含量的影响。(4)采用乳酸酶脱氢法(LDH法)体外检测CPG、PG-1、PG-2对小鼠NK细胞活性的影响。
安全毒理学评价方法:(1)小鼠急性毒性试验:采用最大耐受剂量法,将CPG以21.50g/kg·BW剂量灌胃KM小鼠后,连续观察14d,记录中毒表现及死亡情况。(2)Ames试验:采用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四种菌株进行试验,试验设4个剂量组即10.00、5.00、2.50、1.25mg/皿,观察各组回变菌落数。(3)小鼠骨髓细胞微核试验:剂量为2.50、1.25、0.625g/kg·BW,显微镜下每只动物计数1000个嗜多染红细胞,记录含有微核的嗜多染红细胞数,并计算嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值(PCE/RBC)。(4)小鼠精子畸形试验:试验剂量同小鼠骨髓细胞微核试验,每只小鼠观察1000个精子,记录畸形精子数。(5)30天喂养试验:以剂量0.625、1.25、2.5g/kg·BW进行SD大鼠30天喂养试验,分析CPG对大鼠体重、食物利用率、血常规指标、血生化指标、脏器重量以及脏器指数的影响,并进行大体解剖观察和主要脏器的组织病理学检查。
结果:增强免疫功能实验结果:(1)中剂量(100mg·kg-1)的CPG可极显著性提高正常小鼠免疫器官指数和廓清指数(P<0.01)。高剂量(200mg·kg-1)的CPG可极显著性拮抗CY引起的脾指数降低(P<0.01),并使其恢复正常水平(P>0.05);高剂量CPG可显著性拮抗CY引起的廓清指数降低(P<0.05),并恢复至正常以上水平(P<0.05)。(2)CPG、PG-1、PG-2均可极显著性刺激和协同ConA刺激脾淋巴细胞增殖(P<0.01)。直接刺激时,高剂量(100μg·mL-1)的CPG刺激指数最大,为1.40;协同ConA刺激时,中剂量(50μg·mL-1)的PG-2刺激指数最高,为1.44。(3)低剂量CPG(50mg·kg-1)能极显著性增加正常和免疫低下小鼠的抗体生成细胞数(P<0.01),但高剂量(200mg·kg-1)的CPG未能增加正常小鼠抗体细胞的生成,且抑制免疫低下小鼠抗体细胞的生成(P<0.01)。(4)三个剂量的CPG均可显著性增加正常和免疫低下小鼠的血清溶血素含量,以中剂量(100mg·kg-1)的CPG作用效果最强(P<0.01)。(5)CPG、PG-1、PG-2均可极显著性增强小鼠NK细胞的杀伤活性(P<0.01),PG-2的杀伤活性强于CPG、PG-1,高剂量(100μg·mL-1)PG-2的杀伤率达到42.89%。
安全毒理学试验结果:(1)小鼠的经口急性毒性试验结果显示,试验期间动物无死亡,且未出现异常症状,经口最大耐受剂量大于21.50g/kg·BW。(2)Ames试验结果显示CPG无致突变性,小鼠骨髓细胞微核试验结果显示CPG对小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核形成率无显著影响,小鼠精子畸形试验结果显示CPG对小鼠精子的畸形率无显著影响。三项遗传毒理学试验结果皆为阴性,表明珠母贝糖胺聚糖无明显的遗传毒性。(3)30天喂养试验结果显示各试验组SD大鼠未出现异常症状,也无死亡。CPG对SD大鼠的体重增长、食物利用率、血液学指标、血生化指标、脏体比均无显著性影响。SD大鼠的大体解剖观察和病理组织的镜检观察也未发现明显改变。
结论:珠母贝糖胺聚糖足一种安全无毒的,可开发成具有增强机体免疫功能的保健食品。