流感病毒是引起急性呼吸道疾病的一类病原体，能够在人与动物之间广泛传播，分为甲、乙、丙、丁四型。其中甲型流感病毒具有高致病率和高致死率的特点，每年引起全球的感染病例多达上亿人次，是造成季节性流感和流感大爆发的主要诱因，严重威胁人类的健康和阻碍社会经济的发展。目前，抗流感药物主要作用于神经氨酸酶与M2离子通道两个靶点，因其不断发现的耐药病毒株和副作用的持续出现限制了这两类药物在临床上的应用。为此，寻找新的抗流感病毒靶点以及开发新的抗流感药物成为科学家们试图攻克的难关。　　研发新型的抗流感病毒药物，需要转变目前抗流感药物针对单一靶点的研究思路，从以下两个方面入手:既可以抑制流感病毒的复制（针对病毒），也能够降低流感病毒介导的过度炎症免疫反应（针对宿主）。天然产物因为广泛的药理活性，尤其是毒副作用低，不易诱导耐药性产生的特点，而备受关注，同时天然产物也是绝佳的抗病毒药物筛选库。而且，天然产物在抗流感病毒方面有其独特作用，常常攻守兼备，即具有靶向病毒和靶向宿主的双重药效。　　在前期实验中，我们利用计算机虚拟筛选对TagerMol天然产物库进行了初步研究。本课题以甲型流感病毒聚合酶PB2亚基cap-binding结构域(PB2cap)为靶标蛋白，以荧光偏振作为筛选平台，对初筛出的天然产物进行进一步的筛选，发现杨梅素与二氢杨梅素浓度依赖性的抑制PB2cap与m7GTP的结合，可作为天然来源的小分子抗流感PB2cap抑制剂进行研发。　　研究目的:　　本课题拟研究杨梅素和二氢杨梅素抗甲型流感病毒的活性及作用机制，明确认其作用靶点，并结合杨梅素与二氢杨梅素的体外抗炎作用，研究在甲型流感病毒感染中的免疫调控机制。以期从天然产物中发掘和开发新型抗流感药物，为解决抗流感化药的药性单一、耐药和副作用等问题提供一个新的选择。　　研究方法:　　1.以帽结合实验和荧光偏振实验作为PB2cap活性评价方法，筛选天然来源的小分子抗流感PB2cap抑制剂。　　2.采用MTT法评价杨梅素和二氢杨梅素的细胞毒性，采用细胞病变法、空斑减少实验以及qRT-PCR法测定杨梅素和二氢杨梅素体外抗甲型流感病毒的活性。　　3.采用免疫荧光、western blot和qRT-PCR检测杨梅素和二氢杨梅素对甲型流感病毒复制的影响。　　4.采用H5N1假病毒抑制实验、time-of-addition实验探索杨梅素和二氢杨梅素主要作用于病毒复制的哪个具体阶段。　　5.采用mini-replicon实验检测杨梅素和二氢杨梅素对病毒RNA聚合酶（vRNP）活性的影响。采用荧光偏振实验，SPR技术，分子对接技术用于进一步探索杨梅素和二氢杨梅素与PB2cap蛋白的结合。　　6.qRT-PCR评价杨梅素和二氢杨梅素对甲型流感病毒介导的炎症因子释放水平的影响;使用western blot方法检测相关的信号通路和关键分子。　　研究结果:　　1.杨梅素与二氢杨梅素浓度依赖性地抑制PB2cap与m7GTP的结合。　　2.杨梅素和二氢杨梅素能抑制甲型流感病毒的感染。杨梅素对A/Puerto Rico/8/34(H1N1),A/FM-1/1/47(H1N1)，以及A/Aichi/2/68(H3N2)的IC50分别是9.82±1.81，17.44±4.44，10.74±3.33μM;二氢杨梅素对这三种毒株的IC50分别是15.18±0.92，23.33±4.83，11.67±2.28μM。　　3.通过在流感病毒的不同时间点加药以及H5N1假病毒抑制实验验证杨梅素和二氢杨梅素在流感病毒进入细胞后发挥作用。　　4.在流感病毒的单轮复制阶段，杨梅素作用的时间段是1-3h，二氢杨梅素作用的时间段是3-5h。　　5.杨梅素和二氢杨梅素能够浓度依赖性地抑制流感病毒vRNP复合物的活性。　　6.甲型流感病毒复制时显著上调TLR3基因和蛋白的表达，杨梅素和二氢杨梅素进行干预后，可通过抑制TLR3干扰下游相关细胞因子的表达。　　研究结论:　　1.杨梅素和二氢杨梅素在体外能明显的抑制甲型流感病毒的复制，且作用于病毒复制的早期。　　2.杨梅素和二氢杨梅素通过作用于流感病毒的PB2cap影响病毒vRNP的活性;　　3.杨梅素和二氢杨梅素不仅能直接抑制流感病毒的复制，也能通过TLR3信号通路调控流感病毒感染导致的过度炎症免疫反应。