研究背景:细胞色素酶P450在生物研究的很多领域中都能够编码并表达蛋白,到2018年为止,细胞色素酶P450已经拥有了56年的研究历史,超过50,000种不同的细胞色素酶被发现存在于除了大肠杆菌外的其他动物、植物、真菌、细菌和病毒中。细胞色素酶P450名字的来源是因为这种酶有血红素蛋白,并且与一氧化碳的络合物可以在450 nm处有最大吸收。迄今为止,人类基因组计划已经确定了57种细胞色素酶,并基于其氨基酸序列的相似比将其划分成18个科（用阿拉伯数字表示）和43个亚科（用A,B,C,D等大写字母表示）。由于细胞色素酶本身具有强大的催化性和多样性,所以催化反应类型也多种多样,如羟化反应、脱烷基化反应、环氧化反应和氧化还原反应等。在大多数情况下,细胞色素酶作为一种单加氧酶进行催化反应,即在微粒体系统中电子经过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）传递给细胞色素还原酶,再由其还原酶传递给细胞色素酶,与此同时底物被氧化出羟基而氢离子被还原成水分子。这些细胞色素酶作用广泛,它们参与体内内源性底物的代谢,如CYP3A4催化睾酮合成类固醇等;它们主要参与人体内药物的?相代谢使得这些疏水性的药物更加水溶性有利于被??相代谢中的酶利用并排出体外。事实上据调查研究显示,大约75%的药物都是通过细胞色素酶代谢来发挥药效的,而其中超过90%的药物都是被CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4代谢的;同时细胞色素酶还可以降解某些致癌物质和外来化学物质来达到保护人体健康的作用。综合来说,细胞色素酶有很高的研究价值,具体体现在它可以广泛应用于药物设计、药理学研究、预防化学致癌、植物育种和昆虫防治等各个领域。目前为止,很多细胞色素酶都已经有了很深入的研究（如CYP3A4）,但是仍然有一部分细胞色素酶的代谢机理和生理作用没有被发现。其中,一种叫做CYP4Z1的细胞色素酶引起了我们的关注。这种酶在正常乳腺组织和乳腺癌组织的表达比在人体其他组织多得多,目前为止仅有两篇文章报道了它的底物,其中之一就是我们课题组在2009年发现这种酶可以代谢月桂酸和肉豆蔻酸,但是羟基化位置在脂肪酸的中间而不是像其他同家族的酶一样进行端位羟基化反应。另一篇文章则发现了这种酶可以代谢二十碳二烯酸和花生四烯酸。与此同时,一些报告表明,人类细胞色素酶CYP4Z1不仅可以在所有亚型乳腺癌中表达,也可在其他恶性肿瘤中被检测出来,如卵巢癌、肺癌和前列腺癌;CYP4Z1的3’-UTR能抑制乳腺癌细胞的迁移;在2017年,我们课题组通过检测正常志愿者和乳腺癌患者的血清发现了CYP4Z1可以作为乳腺癌患者的肿瘤对应抗原。所有这些研究结果都表明,人类CYP4Z1有很大可能作为治疗乳腺癌的药物靶向位点,尤其有利于基于前药设计的治癌药物的发展。然而目前为止,关于这种酶的代谢底物、有效抑制剂和蛋白结构尚不足以进行更进一步的药物设计。正是由于细胞色素酶在人体内代谢的重要作用,才有了那么多应用于检测细胞色素酶活性的方法。这种细胞色素酶活性检测方法可以以酶的来源来划分,主要分为重组酶和非重组酶两类检测系统。非重组酶系统中最为典型的应用就是人肝细胞和人肝微粒体。其中前者由于其细胞的完整性和代谢通路的完备性,广泛适用于研究药物诱导、药物代谢稳定性、药物间的相互作用和药物潜在肝毒性的研究中,但是相对而言酶的表达量较少且来源少、价格昂贵;后者适用于药物体外吸收、分布、代谢、排泄和毒性的研究,是广泛应用于生物领域研究药物代谢的体外模型,但是由于其含有多种细胞色素酶,所以存在多种酶活性交叉的状况以致于无法分辨出究竟是哪一种酶起决定性作用,同时也不利于用该系统大量生产代谢产物。与非重组酶系统相比,重组酶可以通过明确地对反应混合物中存在的单个酶进行反应,从而进行单个酶的代谢水平分析。其中最常使用的宿主就是重组大肠杆菌和重组酵母菌。由于大肠杆菌本身没有内源性细胞色素酶,所以不存在酶反应的交叉性,而且利用大肠杆菌的快速繁殖和廉价操作手段有利于大量生产特定代谢物。但是细菌表达系统常伴有N末端截取修饰使得表达的蛋白不能完全与人细胞色素酶相同;酵母仅含有两至三个细胞色素酶并且这些内源性细胞色素酶与人类的并不相似,所以不会对人细胞色素酶反应产生很大影响。基于酵母的基因可操作性、低成本和快速繁殖,我们课题组已经成功导入了很多人类细胞色素酶基因,并使用全细胞生物转化的方法成功合成了很多重要的代谢物。不过这种方法也有一个缺点就是底物或抑制剂需要穿过很多生物屏障才能与酶接触并被其催化,尤其当底物或抑制剂是离子型化合物时这种难度就会加大;除了以上两种系统可以检测酶活,还有纯化的重组酶也可以作为一种可靠的酶源。同样这种方法的优点在于没有多余的副反应发生,但是由于其制备时间长和高昂的费用常常不作为一种首选的酶活检测方法。在2016年,我们组利用渗透过的重组酵母菌成功的生产了尿苷二磷酸葡糖醛酸,产率高达100%,整个酶促反应仅在3个小时内完成。这一跨越性的成功让我们衍生了一个新的想法,那就是能否用同样的渗透原理使得底物更好的与细胞色素酶接触,从而产生跟多的代谢产物。研究目的:本文的主要目的是建立一个高效的、快速的、稳定的检测细胞色素酶活性的方法,并基于此方法发现人CYP4Z1更多的底物和潜在的抑制剂,通过对人CYP4Z1蛋白结构建立同源模型,以实验所得数据为基础使用计算机软件进行底物或抑制剂和酶的分子对接实验,从分子和酶学上更好的解释实验现象并通过软件发现酶活位点和关键氨基酸。结合氨基酸点突变实验的结果修正同源模型,为日后基于此模型进行化合物数据库筛选提供基础,最终使得发展前药治疗乳腺癌的策略得以实现。实验方法:1.构建含有重组人细胞色素酶的酵母菌及其突变体;2.用建立的“酶包”方法检测酶活,即经固体培养基培养三天、液体培养基培养过夜后的酵母菌被0.3%的Triton-X100常温渗透1小时,再用50 mM的NH₄HCO₃洗涤三次后加入睾酮或发光底物37℃下高速震荡反应3小时。检测抑制剂活性的步骤稍微有所不同,在加入底物之前酶和抑制剂要充分混匀并与37℃下预反应十分钟。反应后的产物在悬浮液里经萃取后由HPLC-MS法鉴定或直接加入LDR缓冲液室温反应20分钟后送去检测发光值;3.比较“酶包”新方法和全细胞生物转化法的产率时,底物睾酮和6-β羟基睾酮的检测是在HPLC-MS下完成的,即在240nM处相对应分子量下的峰面积之比即为两物质的浓度值比;4.生物发光法主要用于检测发光底物能否被指定酶代谢时使用,这一类发光底物再被细胞色素酶代谢后可以生成荧光素,再加入荧光素酶后即可生成光子并被酶标仪检测到,酶活和发光值成线性关系;5.由于缺少CYP4Z1的蛋白结构,所以我们使用与其同源相似比最高的CYP4B1为模板,构建了CYP4Z1蛋白的同源模型,并将实验所得的底物与抑制剂在此模型上与酶进行分子对接,从而找到酶活位点和关键氨基酸;6.根据模型预测将构建好的重组酵母菌及其突变体进行酶活检测,依然使用“酶包”法和发光底物,得到的结果将用于修正CYP4Z1蛋白的同源模型。实验结果:我们已经建立了一个基于渗透裂殖酵母细胞并可以检测重组人细胞色素酶活性的方法。与全细胞生物转化法相比,此方法可以利用更少的细胞在更短的反应时间内生成8倍以上的产物,并且渗透洗涤过的酵母细胞可以长时间冻存并保证一个月内活性不变。之后,我们用此方法筛选了15种发光底物,其中13种可以被CYP4Z1代谢,与此同时除了已知的脂肪酸链中羟基化反应外,我们还发现了两种新反应,即醚基断裂反应和芳环羟基化反应。除此之外,我们还发现了新的CYP4Z1的五个抑制剂:咪康唑、益康唑、氨基苯并三唑、妥拉苏林和苄基咪唑,而其中IC₅₀仅有180 nM的苄基咪唑的抑制效果要好于目前唯一报道过的抑制剂HET0016。基于以上实验数据和近期发表的CYP4B1的晶体结构,我们构建了CYP4Z1的同源模型并在计算机模拟了分子对接试验,结果表明构建的模型与已知的底物拟合度很高,同时该模型还预测Ser113、Ser222、Asn381和ser383有可能是活性位点形成氢键的关键氨基酸。为了验证模型的预测并更好的修正模型,我们进行了氨基酸点突变实验并比较了野生型菌株和突变体中CYP4Z1的活性大小,目前初步结果显示单点突变对其活性影响不大。结论展望:我们建立了一个基于渗透重组酵母细胞并可以高效、稳定、快速检测人细胞色素酶活性的方法,并以人的CYP4Z1为靶酶,用此方法成功筛选出了13种新的发光底物和5种抑制剂,为人们更进一步的了解CYP4Z1的代谢和功能提供了研究价值。同时,基于底物和抑制剂的数据,我们以CYP4B1为模板成功构建了CYP4Z1的分子蛋白模型,在底物和酶的分子对接试验中我们发现了酶活位点并找到了可能影响氢键结合的关键氨基酸,即Ser113、Ser222、Asn381和ser383。在构建了氨基端单点突变酵母菌后,我们通过上述方法比较了野生型和突变体中CYP4Z1的活性大小,虽然目前初步结果显示单点突变对其活性影响不大,但是并不能说明突变的氨基酸没有作用,日后我们将继续在此基础上构建多点突变,多方位的比较其活性变化,在得到可靠准确的数据之后修正以构建的同源模型,使它成为真正可以预测CYP4Z1相关特性的分子模型。如果这一模型可以在日后的实验中实现,那么就可以在其基础上对接更多的化合物,预测CYP4Z1的底物和抑制剂,通过大量实验数据验证后发现关键的核心骨架,即可通过该骨架设计CYP4Z1的前药,使其能够特异性的被CYP4Z1代谢并释放活性药物或细胞毒素,进而达到治疗乳腺癌的目的。研究意义:细胞色素酶是人体内参与代谢最重要的一种酶,它的研究和发展有很高的应用价值,具体体现在它可以广泛应用于药物设计、药理学研究、预防化学致癌、植物育种和昆虫防治等各个领域。而本文中建立和发展的这样一种高效的、快速的、可靠的检测其酶活的方法就对其研究和发展起到了推进作用。不仅如此,在越来越多的文章报道人CYP4Z1能够促进乳腺癌的发生和转移时,本文新发现的13种底物和5种抑制剂大大的丰富了人们对这种酶代谢的认识,使得发现CYP4Z1的抑制剂并基于其结构设计合成新的药物提供了思路和方法。同时本文构建的CYP4Z1的同源模型有利于计算机模拟化学品库里的化合物和酶进行对接实验,为发现更多的底物和抑制剂提供了坚实的基础,为设计合成前药提供了有力的途径,为治愈乳腺癌提供了崭新的希望。