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本论文有两方面的研究工作。一是多花黄精低聚糖的制备、结构解析及抗氧化活性研究;二是脂肪酶催化合成西罗莫司衍生物Temsirolimus研究。
近年来,寡糖的研究进入了一个前所未有的快速发展阶段,大量糖疫苗、寡糖类药物相继面世。寡糖的研究,特别是对天然来源寡糖的分离纯化与结构确认,具有重要的临床应用价值。同时由于寡糖极性大,异构体多,结构复杂,对寡糖的研究又具有很高的理论价值。本论文在课题组前期研究基础上,以传统中药材百合科植物多花黄精中的多糖成分为材料,进行了以下研究:
(1)首先从多花黄精中分离得到纯度达98%的多糖组分PCP,采用固相酸(阳离子树脂)催化降解的方法将PCP降解成聚合度不等的寡糖混合物,再利用抗氧化活性筛选模型对黄精多糖降解片段进行活性跟踪,配合ESI-MS确定聚合度大小,获得具有抗氧化活性的低分子量寡糖片段FR-1和FR-2。再利用凝胶排阻色谱Bio-P4和Bio-P2分离寡糖混合物,得到纯度高于90%的单一聚合度2-9糖。对2-9糖进行活性跟踪,研究发现四糖是具有抗氧化活性的最小寡糖,且其活性远高于未降解的PCP。
(2)在此基础上,通过甲基化分析,MS/MSn以及NMR等手段对四糖的结构进行了解析,研究结果表明四糖虽然聚合度单一,但仍存在多种同分异构体,且以直链结构的四糖为主,其中→2)-β-D-Fruf以及(2→1)-β-D-Fruf的含量最多,2→6)-β-D-Fruf次之,并且有的同分异构体具有典型的β-D-Fruf-(2→1)-α-D-Glcp结构,但含量甚微。
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种非典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是抗肿瘤药物设计的一个重要靶标。雷帕霉素及其衍生物是mTOR信号特异性的抑制剂,对肿瘤的靶向性治疗具有重要意义。静脉使用于治疗肾癌的Temsirolimus已经合成上市,但是合成难度较大,生产成本偏高,并且已经申请专利保护,因此对其合成工艺研究具有重要意义。
Temsirolimus的合成主要采用酶合成法,该方法具有专一的选择性,产率较高,但是该方法所使用的酶催化剂价格昂贵,并且酰化试剂为乙烯酯,在合成时需使用贵重金属Pd催化,不够经济环保,并且反应过程中产生乙醛,乙醛的沸点、闪点都很低,与空气混合容易发生爆炸,不太适合工业化生产。本论文在此基础上,对酶合成方法进行改进,筛选了一系列酶催化剂和不同的酰化底物,发现Lipozyme TL IM酶和2,2,5-三甲基-1,3二氧六环-5-羧酸酐具有非常好的效果,收率能达到90%。该方法简单易行,降低了生产成本,能适应工业化生产。