一个基于水稻T-DNA插入突变体库生成的农杆菌介导的一步转化系统的建立

来源 :华南热带农业大学 海南大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qinyalin
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基于水稻大规模T-DNA插入突变体库的建立,我们发展了一个简单、快速、高效的农杆菌介导的一步转化系统。在一步转化系统中,光照高温条件下培养的水稻愈伤组织从诱导开始经过4周时间就可以达到转化实验的要求,并且简化、优化了整个共培养过程,省去了一筛、二筛和预分化步骤,只用7周的时间就可以初步得到再生转化植株;共191块愈伤组织得到125块抗性愈伤组织,转化频率达到65.4%,最后共得到99棵独立来源的再生植株,抗性愈伤组织再生频率达到79.2%。对抗性植株进行PCR扩增检测,结果表明有80.3%的抗性植株为阳性植株;Southern杂交结果进一步证明了质粒的T-DNA已经整合到水稻的基因组中,拷贝数为1~4个,平均每棵转化植株有2.5个拷贝。在实验中我们应用了pCASO4质粒,为提高愈伤组织的筛选效率,我们应用了来自于玉米基因组的ubiqitin强启动子来驱动筛选基因NPTII的表达。在T-DNA的右边界附近有一个不含启动子的GUS基因作为基因捕捉部分,用来测定水稻未知基因的表达模式,在T-DNA的左边界附近有一个水稻的actin-GB强启动子作为激活标签,用来启动水稻基因组中下游序列的表达,从而使标签同时具有基因捕捉标签、激活标签和插入标签的三重作用。在水稻突变体库构建的过程中,对这个标签的基因捕捉系统进行了GUS组织化学染色检测,在水稻的叶、花、未成熟种子和根中的GUS染色阳性率分别为:7.7%(76/985)、34.3%(134/391)、10.4%、(23/221)和12.4%(50/404),其特异表达率分别为23.3%、85.8%、43.5%和44%。实验结果表明:我们的基因捕捉系统在水稻功能基因组研究中是一个强有力的工具;为检测激活标签在水稻功能基因组研究中的可行性,我们检测了actin-GB启动子在水稻中的表达模式和表达强度,GUS组织化学检测和GUS活性检测结果表明:actin-GB启动子在水稻的叶、根和愈伤组织中都有很强的表达活性,是一个组成型强启动子,初步验证了我们的激活标签在水稻功能基因组研究中是可行的。此外,在水稻突变体库建立的过程中,还得到了各种不同的突变体,如不同程度的不育突变体、穗形和粒形发生变化的突变体等,这说明了我们的T-DNA作为插入标签是可以有效地诱导水稻基因产生突变的。
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