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本研究在对从四川省分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)SC1和SC2株进行细胞培养特性、电镜观察和RT—PCR鉴定的基础上，对ORF5基因进行克隆、鉴定和序列分析，构建了ORF5基因和猪白细胞介素2(IL-2)真核表达载体(核酸疫苗)，利用Marc-145细胞、小鼠和猪作为模型研究ORF5核酸疫苗在Marc-145细胞中表达、在仔猪和小鼠体内的动态分布及安全性、诱导仔猪体液免疫和细胞免疫的能力、IL-2的免疫增强等作用进行了系统研究，获得如下结果： 1．猪繁殖与呼吸综合征病毒四川分离株ORF5基因的序列及分析：本研究对SC1和SC2分离株的ORF5基因分别进行pGEM-T载体克隆与测序，并进行了同源性比较和进化树分析，结果，SC-1、SC-2分离株ORF5基因序列与VR-2332株的十分相似，其核苷酸同源性达到99％，氨基酸同源性为98-99％，而与LV株相差甚远，其核苷酸及氨基酸同源性仅为57％和54％，在进化程度上四川分离株与美洲型PRRSV有很近的亲缘关系，表明，这两株PRRSV分离毒可能属于美洲型。同时用BioEdit、TMHMM-2.0、TreeView等软件对该基因所推测的GP5进行了分析，结果表明SC1、SC2分离株的GP5各有6个潜在的疏水区、2个跨膜区和一个潜在的信号肽。 2．PRRSV-ORF5基因真核表达质粒的构建及在Marc-145细胞中表达：采用BamHI和EcoRI酶切，通过定向粘末段连接法，分别构建SC1和SC2分离株ORF5基因真核表达质粒pcDNA-SC1-ORF5(核酸疫苗pcDNA-PRRSV-SC1-ORF5)和pcDNA-SC2-ORF5(核酸疫苗pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5)，并用脂质体转染法和电穿孔转染法将pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5在Marc-145细胞中进行了表达。结果表明，两种转染法都能高效转染pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5质粒，但后者比前者转染的表达时间提前3小时；从特异性荧光结果看，两者转染表达的效果差异不大，分别在转染后26h和23h可用荧光抗体技术检测到特异荧光，并在转染后56h达到高峰。 3．PRRSV-ORF5基因真核表达质粒DNA在小鼠和仔猪体内的动态分布及安 四川农业大学博士学位论文全性研究:以pCDNA一PRRSv一sCZ一ORFS免疫小鼠和仔猪，分不同时间段采集组织样品，通过PcR检测pCDNA一PRRSv一ScZ一oRFS质粒在小鼠和仔猪体内的动态分布情况。结果表明，肌注小鼠后，pCDNA一PRRSV一SCZ一ORFS迅速分布到小鼠其他组织器官中，在脑组织中存留时间最短，只有6周;在注射部位存留的时间最长，可达到14周以上;在血液和心肌中能存留10周;肝脏、肾脏、脾脏和肺组织中能存留8周。肌注仔猪后，同样发现pCDNA一PRRSV一SCZ一ORFS分布到仔猪其他组织器官中。同时未发现pcDNA一PRRSv一sCZ一oRFS与宿主细胞染色体整合现象。 4.猪白细胞介素2(IL一2)真核表达质粒的构建及其应用:构建猪白细胞介素2(IL一2)真核表达载体pCDNA一IL一2，并与pCDNA一PRRSV一SCZ一ORFS共同免疫仔猪，观察工L一2对pcDNA一PRRSv一SCZ一ORFS的免疫增强效果。试验结果表明，儿一2对PcDNA一PRRSV一SCZ一ORFS诱导的体液免疫和细胞免疫应答有明显的增强作用。 5.检测猪繁殖与呼吸综合征抗体间接ELISA方法的建立:本实验以Marc一145细胞增殖、梯度离心法获得的PRRSV一SCZ病毒作为包被抗原建立了检测PRRS抗体间接ELISA方法，通过实验证明该方法具有特异性强、敏感度高、重复性好等特点，适宜作为PRRSV ORFS核酸疫苗免疫猪后抗体的检测。 6.PRRSv一ORFS核酸疫苗诱导仔猪体液免疫的研究:pCDNA一PRRSv一SCZ一ORFS分3种剂量和2种免疫途径对仔猪进行免疫后，用间接ELISA法检测仔猪的体液免疫应答情况。结果表明，pCDNA~PRRSV一SCZ一ORFS在3种剂量和2种免疫途径的免疫中，均能诱导仔猪产生体液免疫应答。大剂量组与中剂量组及小剂量组相比，它诱导体液免疫应答更强，差异显著(P<0 .05)，其中以基因枪免疫组的诱导能力最强，其结果差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)。 7.PRRSV--ORFS核酸疫苗诱导仔猪细胞免疫的研究:采取MTT比色法和流式细胞仪检测仔猪的细胞免疫应答情况。结果表明，pCDNA一PRRsv一ScZ一oRFS在3种剂量和2种免疫途径的免疫中，均能诱导仔猪产生细胞免疫的应答。大剂量组表现出在体液免疫中表现相似的效果，即比中剂量组和小剂量组有较强的细胞免疫应答，差异显著(P<0 .05)，但在两种免疫途径即基因枪免疫组与肌肉注射组中，其诱导的细胞免疫应答差异不显著(P>0.05)。