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棉花（Gossypium spp.）是世界上重要的经济作物,棉纤维是纺织业原料的重要来源,同时棉籽也是重要的植物油脂资源。黄萎病菌（Verticillium wilt）是影响棉花生长发育的最重要真菌病害,严重影响棉花纤维品质和产量。棉花黄萎病菌致病机制及抗病基因的发掘与育种利用一直是棉花抗病遗传育种研究的热点。深入研究黄萎病菌中关键致病基因的功能特征,明确棉花抗病相关基因的作用机理,不仅为棉花与黄萎病菌互作机制的研究提供依据,而且可为棉花抗病品种的培育提供重要的候选基因。目前研究显示,丝裂原激活蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases, MAPK）信号在调节植物真菌菌丝生长、在寄主植物表面的附着生长、特殊的侵染结构、分泌细胞壁降解酶等方面起重要作用。研究者们已经从多种植物病原菌中成功鉴定出多个MAPK通路基因,其中包括位于MAPK信号通路上游的Msb2基因。该基因是一种典型的膜结合型粘蛋白,参与信号传导并且位于丝状生长（Filamentous growth, FG）和高渗透压调节（High osmolarity/glycerol pathway, HOG）信号途径的上游,在植物病原菌侵染寄主植物过程中起着重要作用。而植物在抵抗真菌病害侵染过程中可通过感知病原菌相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）来激活复杂的免疫反应,从而抵御病原菌的侵染。其中,病原真菌细胞壁的主要组成成分一一几丁质就是一类PAMPs.目前研究显示,植物体内存在着两大类几丁质相关基因：几丁质受体蛋白与几丁质酶。几丁质酶通过降解真菌细胞壁释放小分子几丁寡糖,从而抑制真菌的生长。而几丁质受体则可以特异性的识别上述几丁寡糖,从而利用一系列的信号传递激活植物免疫反应。因此,这两类几丁质相关基因在植物免疫反应中起着重要作用。本研究以黄萎病菌落叶型菌株Vd8为材料,克隆了VdMsb基因并初步研究其功能；利用已释放的棉花二倍体亚洲棉（A组）和雷蒙德氏棉（D组）的基因组数据,进行棉花几丁质相关基因家族的全基因组发掘、分类及功能分析。主要研究结果如下：1、利用同源克隆的方法,从黄萎病菌Vd8中克隆到一个膜结合型粘蛋白基因VdMsb （GenBank登录号：KM032761）。该基因ORF全长2688bp,编码含895个氨基酸的蛋白质,分子量和等电点分别为9.06 kD和4.33。生物信息学分析显示,该基因的N-端包含一段由22个氨基酸残基组成的信号肽,C-端包含一个由23个氨基酸残基组成的跨膜区域和一个由14个氨基酸残基组成的高度保守的细胞质尾体。通过对基因全长进行糖基化位点预测,发现该基因一共包含178个糖基化位点。蛋白序列比较发现,黄萎病菌VdMsb蛋白与尖孢镰刀菌FoMsb2和稻瘟病菌MoMsb2的相似度达到了49.27%和48.78%。不同来源的]dMsb类同源基因在跨膜区和细胞质尾体部分高度保守。利用农杆菌介导的遗传转化方法（Agrobacterium tumefaciens mediated transformation, ATMT）,成功获得该基因的缺失及互补突变体。通过表型观察发现,缺失突变体dmsb的微菌核占整个菌落的比例显著性下降,整个菌落呈现为白色。而互补突变体Amsb+Msb相对于△msb突变体而言,表型恢复正常,与野生型Vd8表型相同。说明VdMsb基因有无与黄萎病菌微菌核的形成显著相关。对不同突变体及野生型进行致病力分析发现,接种△msb突变体的棉花植株发病速度较为平缓,接种30天后平均病级指数为37.5%。相对与野生型和互补突变体,致病力明显下降。相似的结果也在接种拟南芥实验中重演。说明VdMsb基因是黄萎病菌致病的关键基因。进一步研究发现,野生型Vd8和Amsb+Msb突变体菌株样品中孢子浓度无显著性差异,分别为4.49±1.01×107和4.82±0.97×107个孢子。而△msb突变体菌株的产孢能力明显下降,仅2.63±0.86×107个孢子。利用不同突变体及野生型菌株的孢子悬浮液处理拟南芥和棉花根部组织,以明确VdMsb基因缺失突变体致病力下降的原因。通过电镜扫描分析发现,缺失突变体△msb菌株在拟南芥根部附着的菌丝要明显少于野生型Vd8和互补突变体Amsb+Msb。黄萎病菌在棉花中侵入生长分析发现,接种野生型Vd8和Amsb+Msb突变体菌株的棉花幼苗茎秆中出现了维管束褐化现象,说明病原菌已经进入棉花维管束；而接种△msb突变体菌株的棉花幼苗茎秆无明显变化。以上结果说明,VdMsb基因与黄萎病菌的产孢能力、根部附着能力和侵入生长能力紧密相关,是黄萎病菌关键的致病基因。2、利用二倍体雷蒙德氏棉及亚洲棉全基因组序列信息对棉花LysM基因家族成员进行全基因预测。分别从A组和D组中获得28和26个LysM基因。根据其结构域特征及聚类分析将上述基因分为LYK、LYP、LysMe和LysMn四类。染色体定位表明,LysM基因家族成员分布在12条染色体上。根据其在染色体上的位置依次命名为GrLYK1-GrLYK8、GrLYPl-GrLYP4、GrLysMel-GrLysMe7和GrLysMnl-GrLysMn7,并按照同源性对A组成员进行命名。以棉花抗病品种海岛棉Hai7124的根、茎和叶为材料,利用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）共研究12个LysM基因在棉花不同组织器官中的表达特征。表达分析表明LysM类基因组织器官表达的多样性。其中在根、茎和叶三种组织器官中都表达的基因有4个：GbLYP1、GbLYP2、GbLysMn3和GbLysMn7。在根中优势表达的基因有5个：GbLYK1、GbLYK5、GbLYK7、GbLysMel和GbLysMe2、从表达水平分析结果发现3个基因在根部表达量较高,分别是GbLYP1、 GbLysMn7和GbLYKS.其中,GbLYP1和GbLYK5明显受黄萎病菌诱导表达,而GbLysMn7在病菌处理后表达水平未发生显著性变化。通过同源克隆技术,成功从海岛棉Hai7124中克隆了GbLYP1和GbLYK5基因。其中,GbLYP1基因ORF全长1080bp,编码359个氨基酸,分子量和等电点分别为38.7kD和5.54GbLYK5基因ORF全长2013bp,编码670个氨基酸,分子量和等电点分别为73.7kD和5.90。VIGS实验结果显示,注射pTRV2-GbLYKS和pTRV2-GbLYP1的棉花幼苗真叶出现了严重的黄化、萎蔫和脱落等典型的黄萎病感病症状。病级指数分别达到了73%和66.7%,而对照组病级指数仅为35.4%。病级指数与目标基因未沉默的对照相比,存在着极显著的差异。说明GbLYK5和GbLYPl基因在棉花抗黄萎病过程中起重要作用。3、利用二倍体雷蒙德氏棉及亚洲棉全基因组序列信息,从A组和D组中分别获得49和46个几丁质酶基因。根据其结构域特点及进化关系分为五类：Class Ⅰ-Ⅴ。进一步对来源于雷蒙德氏棉D基因组的几丁质酶基因家族成员进行染色体定位,发现46个几丁质酶基因分布在12条染色体上。根据其在染色体上的位置依次命名为GrChi1-GrChi46,并按照同源性对A组成员进行命名。利用同源基因相似性原理,以棉花抗病品种海岛棉Hai7124的根、茎和叶为材料,研究了37个几丁质酶基因在棉花不同组织器官中的表达特征。表达分析发现,Chi类基因组织器官表达的多样性。其中在根、茎和叶三种组织器官中都2个,GbChi31和GbChi46。在根部优势表达的基因有21个,其中GbChi3和GbChi22两个基因的表达量最高。有7个基因在茎部优势表达,其余9个基因在叶中优势表达。黄萎病菌诱导表达分析发现,GbChi3、GbChi22、GbChi31和GbChi46四个基因受黄萎病菌诱导后表达量显著提高,其中GbChi22受黄萎病菌诱导表达量最高。通过同源克隆技术,成功从海岛棉Hai7124中克隆了GbChi22,该基因ORF全长1107bp,编码368个氨基酸,分子量和等电点分别为93.6kD和5.04。其N端有信号肽结构（SP）,一个Glycohydro18结构域,基因组序列中包含一个内含子。利用病毒诱导的基因沉默技术,对GbChi22基因进行功能分析。接种黄萎病菌V991后,注射pTRV2-GbChi22载体的棉花幼苗真叶出现了严重的黄化、萎蔫和脱落等典型的黄萎病感病症状。病级指数达到了68.8%,而对照组病级指数仅为35.4%。病级指数与目标基因未沉默的对照相比,存在着极显著的差异。说明GbChi22基因的表达沉默严重影响棉花对黄萎病菌的抗性。