真核生物基因表达的调控是目前分子生物学研究中重要的前沿领域，形成了多个热点。而转录水平的调控是基因表达过程中最重要的第一步，由于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA之间的相互作用，以及一些复杂大分子复合物的形成导致真核生物的转录水平的调控是一个多级的复杂过程。其中，启动子和反式作用因子在基因转录水平的调控中起到非常重要的作用。 真核生物基因转录水平的调控中，启动子对于目的基因的表达非常重要。用来进行外源基因表达的启动子都是根据生物体中存在的启动子开发出来的。天然的启动子种类繁多，而且各具特点。有些启动单基因的转录，而另外一些与多个基因的转录有关；有些单独启动基因的转录，但也有两个或多个启动子共同启动一个或多个基因的转录。尽管有很多证据表明自然界中存在双启动子作用于同一基因的情况，但较少有人将其应用于外源基因的表达。 反式作用因子在转录调节中具有特殊的重要性。它是能直接或间接地识别或结合在顺式作用元件8～12bp核心序列上，参与调控靶基因转录效率的一组蛋白质。这类DNA结合蛋白有多种，能特异性识别这类蛋白的序列也有多种，正是不同的DNA结合蛋白与不同的识别序列之间的空间结构上的相互作用，以及蛋白质与蛋白质之间的相互作用构成了复杂的基因转录调控机制的基础。 乙型肝炎病毒（HBV）严重危险人类的健康。目前广泛采用的抗HBV治疗药物α-干扰素与核苷类似物，对清除共价闭合环状DNA均无良好的效果，难以彻底清除病毒，因此都存在着不能从根本上清除体内的乙肝病毒，停药易复发，长期应用易产生耐药性等缺点。所以寻找一种新的高效、低毒且能彻底清除体内HBV的治疗方法显得十分重要。 HDV核酶是目前发现的唯一在人体细胞具有天然裂解活性的核酶类型，它的活性发生在HDV基因组复制的中间环节。HDV的复制依赖于HBV编码的蛋白质，在其生活史中一直伴随着HBV的存在。因此，研究将HDV核酶作为HBV的反义抑制剂可能有着其独特的优势。 研究目的： 探讨各种不同的双启动子、单启动子对目的基因表达的影响；通过筛选启动子以及可能增强外源基因表达的反式作用因子来优化靶向乙型肝炎病毒的HDV核酶表达载体，探讨其对乙型肝炎病毒复制的抑制作用。同时为后续提高表达HDV核酶的逆转录病毒滴度的研究奠定基础。 研究方法： 1．双启动子驱动EGFP载体的构建：利用PCR方法，扩增U2和U3启动子，然后应用DNA重组技术构建含有四种双启动子（CMV-H1、CMV-U2、CMV-U3、CMV-U6）的pEGFP表达载体，并用PCR、酶切和测序方法鉴定重组质粒。 2．重组双启动子载体的转染和检测：利用脂质体法将上述重组载体转染293T细胞，并于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光，应用流式细胞术检测重组载体的转染效率以及荧光指数（转染效率与平均荧光强度的乘积）。 3．不同启动子驱动HDV核酶的逆转录病毒载体构建：应用DNA重组技术构建含有六种不同启动子（CMV、H1、tRNA、U2、U3、U6）以及两种不同HDV核酶（针对HBV序列的PreS2、C区）的pLEGFP表达载体，并用PCR、酶切和测序方法鉴定重组质粒。将重组载体利用脂质体法转染HepG2．2．15细胞，并于荧光倒置显微镜下观察绿色荧光，应用ELISA方法检测HBsAg和HBeAg的表达。 4．含有不同反式作用因子的逆转录病毒载体构建：利用RT-PCR方法，扩增出GAPDH，然后应用DNA重组技术构建含有六种不同反式作用因子（β-globin、GAPDH、Mst167、Rev、Tat、X）的pL-U6-Rz表达载体，并用PCR和酶切方法鉴定重组质粒。 研究结果： 1．经PCR、酶切和测序鉴定重组质粒，证明成功构建了pEGFP-H1、pEGFP-U2、pEGFP-U3、pEGFP-U6等含CMV和H1、U2、U3与U6的真核表达载体。 2．将载体pEGFP及上述重组质粒用脂质体法瞬时转染293T细胞，流式细胞检测转染率分别为26．57±1．54％、28．57±0．99％、16．14±1．69％、22．63±1．77％和17．89±1．84％，荧光指数FI值分别为142．79±31．26、103．59±25．90、19．67±0．52、58．164±14．58和15．40±1．92，结果显示构建的各双启动子载体没能提高转染效率，也没能增强EGFP的表达。 3．经PCR和酶切鉴定重组质粒，证明成功构建了由CMV、H1、tRNA、U2、U3以及U6等不同启动子驱动的针对乙型肝炎病毒HBV前S2基因以及C基因的重组载体pLEGFP-CMV-S2/C，pLEGFP-H1-S2/C，pLEGFP-tRNA-S2/C，pLEGFP-U2-S2/C，pLEGFP-U3-S2/C，pLEGFP-U6-S2/C。 4．将pLEGFP及上述含不同启动子的重组质粒用脂质体法瞬时转染HepG2．2．15细胞。ELISA检测HDV核酶对HBsAg抑制在40-85％之间，最高达到84．9％，对HBeAg抑制在6-55％之间，最高可达53．5％。 5．经PCR和酶切鉴定重组质粒，证明成功构建了pL-globin-U6-S2/C，pL-GAPDH-U6-S2/C，pL-Mst167-U6-S2/C，pL-Rev-U6-S/C，pL-Tat-U6-S2/C，pL-X-U6/C真核表达载体。 研究结论： 本课题成功构建了分别含有不同双启动子、单启动子以及反式作用因子的真核表达载体；并利用脂质体法将重组载体转入细胞，通过观察绿色荧光、流式细胞术、ELISA等方法分析各种不同的双启动子以及单启动子驱动目的基因的表达效果，双启动子并不能提高EGFP的表达，各种单启动子较好驱动HDV核酶的表达；同时显示HDV核酶能够显著得抑制HBV基因的复制与表达。