黄病毒（Flavivirus）属黄病毒科（Flavivirde），黄病毒属（Flavivirus），是一类主要由蚊虫或者蜱虫传播的虫媒病毒，目前已经发现有70多个黄病毒家族成员，其中包括重要的人类病原体如乙型脑炎病毒（JEV），登革病毒4个血清型(DV1-4)，黄热病毒（YFV），西尼罗病毒(WNV)，蜱传脑炎病毒(TBEV)以及最近流行的寨卡病毒(ZIKV)。黄病毒流行分布范围广阔，目前，除南极洲以外，其他地区均有黄病毒属病毒的流行，严重威胁着人类健康以及社会公共安全。　　目前针对黄病毒的感染没有特效的治疗手段，疫苗接种是预防黄病毒感染的最主要途径。而在对人具有致病能力的黄病毒中，临床上只有少数几种黄病毒具有可用疫苗，分别为蜱传脑炎疫苗，黄热疫苗和乙型脑炎疫苗以及最近上市的四价登革疫苗，这些疫苗的使用有效地控制了病毒感染和疫情的爆发。然而，这些疫苗，除新上市的登革病毒疫苗不明确之外，仍然存在一定的不足之处。临床上使用的蜱传脑炎病毒疫苗主要有四种，这四种疫苗全部为灭活疫苗，接种价格昂贵，流程繁琐，免疫效果不理想，因此研制价格低廉并具有高免疫效价的蜱传脑炎减毒活疫苗具有重要意义。虽然黄热病毒疫苗株YF17D作为减毒活疫苗具有显著的免疫保护效果并且被广泛使用，但是仍然残留了一定的病毒毒力，免疫接种后存在病毒感染的风险，而这一问题在儿童以及免疫系统缺陷人群中尤为突出，因此有必要构建新一代的减毒疫苗株，在保证疫苗免疫原性的同时，进一步减低病毒毒力，提高疫苗的安全性。　　黄病毒反向遗传学技术的发展大大促进了病毒毒力，减毒特征的研究以及新型疫苗的设计。为实现新型黄病毒减毒活疫苗的理性设计，我们以乙型脑炎病毒和黄热病毒的反向遗传学技术平台为基础，分别采用了嵌合技术，基于内部核糖体进入位点的减毒策略以及共表达免疫小分子方式，构建了相对应的减毒活疫苗候选株，进一步，对这些疫苗候选株的病毒学及免疫学特征进行了系统性评价，分析其是否符合能够作为新型的减毒活疫苗，同时明确以上策略能否应用于黄热减毒活疫苗设计。　　本研究主要分为三个部分。　　1.以乙型脑炎病毒疫苗株为骨架的蜱传脑炎病毒嵌合疫苗的合理设计　　为了设计蜱传脑炎的减毒活疫苗，我们通过基因工程技术，以乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2为骨架，将TBEV主要的结构蛋白prME基因替换到SA14-14-2上，通过反向遗传学技术成功获得了嵌合病毒，命名为ChinTBEV，进一步对ChinTBEV的生物学特征和免疫学特征进行了评价。结果显示，ChinTBEV能够有效表达TBEV的结构蛋白以及JEV的非结构蛋白，并且在哺乳动物细胞系上具有与亲本病毒相似的复制效率以及良好的遗传稳定性；ChinTBEV噬斑特征与SA-14-14-2相似，但噬斑直径显著减小；ChinTBEV感染小鼠后无病毒血症产生，与 TBEV相比，其神经侵袭力显著降低；虽然 ChinTBEV仍存在一定的神经毒力，但具有减弱特征；单次免疫ChinTBEV后即可诱导小鼠产生针保护性抗体，并且能够保护小鼠抵抗致死剂量 TBEV的感染。上述结果表明，我们构建的ChinTBEV具有良好的遗传稳定性，减毒特征及免疫原性，与传统灭活疫苗相比，具有显著免疫效价，可作为TBEV减毒活疫苗使用。　　2.基于内部核糖体进入位点（IRES）策略的黄热减毒活疫苗的合理设计　　为了获得更加安全的黄热病毒减毒活疫苗，我们采用IRES介导的减毒策略，通过基因工程手段和反向遗传学技术，将 EMCV的IRES序列插入到黄热病毒YF17D的基因组中。IRES序列位于 C蛋白基因下游并起始下游病毒蛋白的翻译。通过体外拯救，我们成功获得了包含 IRES序列的重组黄热病毒 YF-IRES，并进一步对其生物学特征进行了评价。结果显示，YF-IRES具有明显的小斑特征；在BHK-21细胞和Vero细胞上其复制效率同亲本病毒相似，同时具有良好的遗传稳定性；在IFN信号通路完整细胞系上，YF-IRES的复制受到明显抑制，在蚊虫细胞系上，其复制则被完全抑制；由于IRES的插入，YF-IRES对IFN处理的敏感性显著升高；YF-IRES的神经毒力显著降低，并且在BALB/C小鼠颅内的增殖完全受到抑制；YF-IRES的神经侵袭力和内脏嗜性显著减弱，并且腹腔途径感染AG129小鼠后，YF-IRES对AG129小鼠无致病力，而在各组织中，虽然仍有一定的病毒滴度，但病毒滴度显著降低；YF-IRES免疫小鼠后能够诱导较高水平的IgG抗体以及中和抗体产生，完全保护小鼠抵抗致死剂量YF17D的攻击。综上，通过IRES策略设计的黄热病毒重组病毒与现有的疫苗株YF17D相比，具有显著的减毒特征，然而仍然保持了良好的免疫原性，免疫保护性以及遗传稳定性，可作为新一代黄热病毒减毒活疫苗使用　　3.共表达IFN的乙型脑炎减毒活疫苗的合理设计　　IFN是一类具有重要作用的免疫调节小分子，它们不仅具有重要的抗病毒作用，还能够有效激活免疫细胞如自然杀伤性细胞以及巨噬细胞，此外IFN还能上调主要组织相容性复合体（MHC）的表达，从而提高抗原呈递作用，提高疫苗效价，可应用于病毒疫苗的设计。在本研究中，我们使用乙型脑炎病毒的反向遗传学技术，将IFN基因插入到携带IRES序列的重组乙型脑炎病毒的基因组中并成功获得了能够共表达IFN的乙型脑炎重组病毒，命名为JEV-IRES-IFN，进一步在细胞水平上对重组病毒的生物学特征以及共表达的IFN活性进行了评价。结果显示，JEV-IRES-IFN在BHK-21细胞上复制效率与JEV相比没有显著性差异，而其形成的噬斑直径与JEV相比明显减小；JEV-IRES-IFN能够有效表达自身病毒蛋白以及IFN，并且IFN表达量与病毒滴度呈正相关关系；JEV-IRES-IFN表达的IFN能够有效激活IFN通路，上调ISGs基因的表达，不仅抑制了JEV的自身复制，还能有效抑制共感染的TBEV以及CHIKV的复制。上述结果说明，我们成功构建的重组乙型脑炎病毒不仅能够完整编码自身病毒蛋白，同时还能表达具有良好生物学活性的IFN小分子，能够抑制本身病毒的复制，降低自身病毒毒力的同时，还能抑制其他病毒的复制，具备了广谱抗病毒作用。本研究不仅仅为乙型脑炎减毒活疫苗的设计提供了新的思路，同时也对新型多功能疫苗理性设计具有很好的指导意义。　　综上，本研究立足黄病毒反向遗传学技术，以黄热病毒和乙型脑炎病毒全长感染性克隆为基础，使用三种不同的新型减毒活疫苗策略，分别构建了三种重组病毒，与现有疫苗相比较，均显示出明显优势，不仅仅可以作为新一代减毒活疫苗使用，同时为其他黄病毒减毒活疫苗的设计提供了新的思路。