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目的:三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)为雌激素受体、孕激素受体及Her-2受体均表达阴性的乳腺癌类型,也是难治性乳腺癌中的代表类型。这类患者具有发病年龄轻,复发转移率高、内分泌治疗基本无效、生存期短等临床特点,并一度是国内外学者研究的重点。近年有研究者发现,在部分雌激素受体阴性的乳腺癌组织中,非经典的雌激素受体G蛋白偶联雌激素受体30(G protein-coupled recepter,GPR30)呈现较高的阳性表达,雌激素有可能通过与GPR30的结合继续发挥促进乳腺癌发生、发展的作用。因此,GPR30有可能成为三阴性乳腺癌新的治疗靶点。而GPR30的作用机制与经典雌激素受体不同,它可反式激活表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)及其下游信号通路发挥快速的非基因型雌激素效应。另有研究提示,EGFR高表达的乳腺癌患者预示预后不良,并对指导乳腺癌临床治疗具有一定临床意义。进一步深入研究发现,GPR30可间接通过激活EGFR-MAPK/Erk通路促进肿瘤细胞的增殖。那么,GPR30与EGFR下游其他信号通路之间是否也有相互作用并对三阴性乳腺癌转移行为产生影响呢。磷脂酰基醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)是EGFR下游信号通路中重要的信号分子,PI3K/Akt信号通路在多种恶性肿瘤中都有异常激活及过表达现象,提示此条信号通路可能在肿瘤转移进程中也发挥着重要作用。本研究旨在探讨在高表达GPR30的三阴性乳腺癌细胞中,GPR30与PI3K/Akt信号通路之间是否存在相互影响,并协同影响乳腺癌转移。方法:1细胞培养在含5%CO2、37℃的恒温培养箱中,用含15%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养乳腺癌细胞系。2采用Western-blot的实验方法检测4种不同病理类型的乳腺癌细胞系中GPR30蛋白表达情况。3采用免疫荧光染色实验方法检测gpr30在三阴性乳腺癌细胞mda-mb-468中的定位。4采用western-blot实验方法检测随着雌二醇(e2)及gpr30特异性激动剂(g1)的刺激浓度梯度及时间梯度的增加,mda-mb-468细胞p-pi3k的蛋白表达水平。5采用western-blot的方法检测使用gpr30特异性阻断剂(g15)阻断e2和g1对gpr30的活化效应后,mda-mb-468细胞内p-pi3k的蛋白表达水平。6采用划痕实验检测gpr30-pi3k/akt信号通路对肿瘤迁移能力的影响。7统计学方法:采用spss21.0统计软件进行数据处理,计量资料采用x±s表示,组间比较采用单因素方差分析,采用lsd法进行组间两两比较,以p<0.05为差异有统计学意义。结果:14种乳腺癌细胞mda-mb-468、mcf-7、mda-ma-231及mda-mb-453,westernblot法检测gpr30的蛋白表达量分别为0.74±0.065、0.92±0.06、0.22±0.04、0.59±0.045;从结果可看出,三阴性mda-mb-468细胞及er阳性的mcf-7中gpr30高表达,而另一种三阴性乳腺癌细胞mda-ma-231则几乎不表达(p<0.05)。2由免疫荧光染色实验结果得出,gpr30主要位于细胞的胞质中。3e2浓度梯度为0ng5ng10ng20ng,刺激mda-mb-468细胞后p-pi3k蛋白表达水平分别为:0.98±0.06、1.18±0.061、1.40±0.086、1.5±0.025;e2时间梯度为0min、5min、10min、20min,p-pi3k蛋白表达水平分别为:0.96±0.042、1.17±0.04、1.49±0.031、0.74±0.056;g1浓度梯度为0nm1nm10nm100nm,刺激mda-mb-468细胞后p-pi3k蛋白表达水平分别为:0.96±0.08、1.17±0.042、1.33±0.036、1.47±0.059;g1时间梯度为0min、5min、10min、20min,p-pi3k蛋白表达水平分别为:0.92±0.035、1.18±0.026、1.44±0.122、0.75±0.049。统计分析得出,随着gpr30激动剂浓度及时间的增加,p-pi3k蛋白表达水平也逐渐增加,并具有浓度及时间依赖性(p<0.05);此实验结果提示:激动剂活化gpr30后,很可能反式激活了egfr下游pi3k/akt信号通路,使p-pi3k蛋白表达增加,进而参与促进肿瘤进展。4通过westernblot法检测control、e2处理组、g1处理组、e2+g15处理组、g1+g15处理组各组p-PI3K蛋白半定量水平分别为:0.95±0.04、1.43±0.05、1.42±0.03、0.58±0.06、0.62±0.10;实验结果示,E2及G1处理组p-PI3K蛋白表达显著升高,而加入GPR30特异性阻断剂G15的处理组p-PI3K蛋白表达水平显著降低(P<0.05),此实验结果进一步说明了GPR30与PI3K/Akt信号通路之间可能存在某种相互关系。5划痕实验测分组为control、E2处理组、G1处理组、E2+G15处理组、E2+LY294002处理组、G1+G15处理组、G1+LY294002处理组,各组细胞迁移距离分别为(55.33±11.37)μm、(263.67±19.76)μm、(272.33±9.29)μm、(51.67±3.51)μm、(49.33±4.04)μm、(55.67±4.04)μm、(56.33±8.50)μm;由此实验结果可看出,E2及G1处理组与对照组相比细胞迁移能力显著增强(P<0.05),而不论是使用GPR30特异性阻断剂阻断GPR30的活化效应还是使用PI3K抑制剂阻断磷酸化PI3K的作用,都可明显减弱细胞迁移能力(P<0.05);此结果提示,GPR30-PI3K/Akt信号通路的活化可影响乳腺癌细胞的迁移能力。结论:1随着激动剂E2和G1刺激浓度梯度及时间梯度的升高,P-PI3K蛋白表达水平也逐渐升高,提示GPR30与PI3K/Akt信号通路之间确实可能存在某种相互关系。2 E2及G1活化GPR30后,可反式激活PI3K/Akt信号通路,促进肿瘤细胞迁移能力;但通过抑制剂抑制GPR30或者PI3K的活化效应,阻断这一信号通路后,肿瘤细胞迁移能力则明显减弱。3综合以上实验结果我们初步证实,GPR30与PI3K/Akt信号通路之间可能通过某种方式存在交叉关系,并进一步对乳腺癌细胞转移产生重要影响。