背景：随着人口的不断老龄化，脑血管疾病的风险因素如糖尿病逐年增加，缺血性脑血管病的发病率呈现出逐年上升的趋势，且致残率高，给每一个家庭带来巨大的经济和心里负担。尽管各国的神经科学界投入大量精力进行该类疾病的相关研究，但就缺血性脑血管病的神经保护方面，至今尚无确切有效的方法真正通过临床试验成为能让脑梗死患者获益的治疗手段，这其中就包括氧自由基清除剂、钙离子拮抗剂、谷氨酸受体抑制剂等。因此我们在探索新的缺血缺氧性脑损伤的神经保护治疗途径显得非常必要，也非常紧迫。　　 腺苷(Adenosine，ADO)作为一种神经递质和调质，广泛分布于神经系统、心血管系统、肾脏、胃肠道等组织，调节着各种重要的生理功能。ADO通过与其特异的受体A1R、A2AR、A2BR和A3R结合，参与了多种神经系统疾病的病理生理过程。在ADO的四种受体中，A1R和A2AR在脑内的分布及数量明显多于另外两种受体，且与ADO的亲和力也更强。既往的研究发现，ADO作为一种重要的神经递质，其神经保护功能是通过激活其抑制性受体A1产生的，并证明A1受体激活产生的神经保护作用与抑制了谷氨酸介导的兴奋性毒性有关[1-3]。在正常情况下，ADO生理浓度仅为40nmol/L-400nmol/L；研究发现在脑供血不足和缺氧性等损伤后脑内细胞突触间隙外液中腺苷水平明显升高(达正常时200倍以上)，并作用于受体发挥其调节作用，与此同时以谷氨酸为代表的兴奋性氨基酸的浓度也急剧升高，并启动了脑缺血后一系列病理生理过程最终导致了神经细胞的坏死或凋亡[3-4]。而在本课题组在前期的实验中发现，腺苷A2A受体基因敲除后能显著减少脑缺血/再灌注区细胞外的谷氨酸浓度，并改善神经功能，减少脑梗死体积[5]，但确切机制尚未阐明。可以看出，在脑缺血状态下急剧增加的ADO并没能通过激活A1受体起到保护神经元的作用。反之，在脑缺血/再灌注后A2AR激活并抑制A1R可能是导致脑缺血损伤的重要原因。因此我们假设，A2AR与A1R间存在相互拮抗作用，在脑局灶缺血条件下，腺苷A2A受体表达增加并抑制了A1R的功能，当阻断A2AR后产生的缺血性神经保护作用，与其激活或保护了A1受体功能有关，并抑制了谷氨酸介导的兴奋性毒性级联反应。既往研究还发现，在中枢神经系统中，谷氨酸转运体负责向细胞内转运谷氨酸。在谷氨酸转运体各亚型中，GLT-1主要分布于纹状体区等前脑的神经胶质细胞，承担转运细胞间隙中谷氨酸的主要任务。前期的预实验发现大鼠MCAO模型使用腺苷A2A受体抑制剂(SCH58261)所起到的神经保护作用与缺血区GLT-1增加有关，减轻神经元的损伤及兴奋性递质的传递[6]。由此，本课题计划从影响GLT-1及腺苷A1表达的角度深入探讨A1-A2A受体相互作用对小鼠脑缺血/再灌注损伤诱导的谷氨酸释放增加调控的分子机制。　　 本实验以腺苷A2A受体基因敲除小鼠大脑中动脉缺血2小时/再灌注22小时模型作为研究对象，观察A2AR基因敲除对A1R表达的影响；从整体水平观察激活或抑制A1R功能对A2AR缺失后神经保护作用的影响，并观察缺血/再灌注区GLT-1表达的变化，试图揭示腺苷受体的缺血性神经保护的可能机制，为开拓缺血性神经保护治疗的新途径提供实验依据。　　 方法：　　 以腺苷A2AR基因敲除小鼠作用研究对象。采用PCR扩增方法鉴定小鼠基因型，并筛选出实验所需的腺苷受体A2A基因敲除小鼠(A2AR/KO)与同窝野生型小鼠(A2AR/WT)制备成MCAo模型，采用免疫荧光法及Western-blot方法检测缺血/再灌注区(纹状体区)A1R表达变化；制备MCAo前检测各组小鼠正常，分别给予腺苷A1受体拮抗剂DPCPX及激动剂CPA处理各组小鼠，观察缺血2小时/再灌注22小时后每组小鼠神经功能缺损程度及脑梗死体积的变化、采用免疫印记法、Western-blot方法检测各组小鼠在MCAo缺血2小时/再灌注22小时后各组小鼠缺血/再灌注区(纹状体区)GLT-1的表达情况。　　 结果：　　 1.缺血/再灌注后，腺苷A2A受体缺失增加了A1受体的表达　　 (1)Western Blot：腺苷A2A受体基因敲除小鼠(A2AR/KO)与野生型小鼠(A2AR/WT)分别制作成MCAo缺血2小时与缺血2小时/再灌注22小时模型，假手术组KO小鼠与WT小鼠纹状体区A1表达无明显差异；在缺血2小时以后A2AR/WT与A2AR/KO组比较，A1的表达未见明显差异；缺血2小时/再灌注22小时后，WT组小鼠A1表达下降，而KO组小鼠A1表达明显升高。　　 (2)免疫荧光：腺苷A2A受体基因敲除小鼠(A2AR/KO)与野生型小鼠(A2AR/WT)制作成大脑中动脉缺血2小时/再灌注22小时模型，假手术组KO小鼠与WT小鼠纹状体区A1R阳性细胞数量无明显差异；在缺血2小时后，WT小鼠纹状体区A1R阳性细胞有所减少，而KO小鼠A1R阳性细胞数量减少不明显；在缺血2小时/再灌注22小时以后WT小鼠纹状体区A1R阳性细胞明显下降，而KO小鼠A1R阳性细胞明显增加，该结果与WB结果基本一致。　　 2.阻断A1受体后，由A2AR基因敲除产生的脑缺血/再灌注损伤的保护作用被削弱，而激活A1R后，这种保护作用增强　　 (1)神经功能缺损评分：缺血2小时/再灌注22小时后，无干预组、A1拮抗剂组与A1激动剂组的KO小鼠神经功能评分均明显低于同组的WT组小鼠(P<0.05，P<0.01)；在使用了A1R拮抗剂以后，无论KO小鼠还是WT小鼠神经功能评分增加，明显高于无药物干预组(P<0.05，P<0.01)；A1R激动剂组，无论KO小鼠还是WT小鼠神经功能评分均降低，明显低于无药物干预组(P<0.05，P<0.01)。　　 (2)脑梗死体积测算：缺血2小时/再灌注22小时后，无干预组、A1拮抗剂组与A1激动剂组的KO小鼠梗死体积均明显低于同组的WT组小鼠(P<0.01)；当使用A1受体拮抗剂以后，无论KO小鼠还是WT小鼠，其脑梗死体积均明显大于非干预组，(P<0.01)；当使用A1受体激动剂以后，无论KO小鼠还是WT小鼠，其脑梗死体积均明显小于非干预组，(P<0.01)。　　 3.在不同A1活性状态下，A2AR基因敲除对脑缺血后GLT-1表达量的影响　　 (1)Western Blot法检测GLT-1的表达：假手术组，WT与KO小鼠纹状体区GLT-1表达无明显差异。缺血2小时/再灌注22小时后WT小鼠GLT-1表达较缺血前减少，而KO小鼠其GLT-1表达无明显减少，表达量明显多于WT小鼠；在使用A1拮抗剂后，KO小鼠的GLT-1表达下降，明显低于非药物干预组；而使用A1激动剂后KO小鼠纹状体区GLT-1表达增加，在WT组，各干预组GLT-1表达差异不明显。　　 (2)免疫荧光法检测GLT-1的表达：缺血前WT与KO小鼠GLT-1的表达无明显差异，在缺血2小时/再灌注22小时后无药物干预组WT与KO小鼠纹状体区GLT-1阳性细胞数量较假手术组有所减少，WT小鼠这种减少程度更为明显；使用A1R拮抗剂以后，WT组小鼠与KO小鼠纹状体区GLT-1阳性细胞明显少于非药物干预组；在使用A1R激动剂以后，KO组小鼠GLT-1阳性细胞较非药物干预组及A1R拮抗剂组明显增多。　　 结论：　　 1.在缺血/再灌注损伤条件下，腺苷A2A受体缺失能增强腺苷A1的表达，其激活或保护了A1受体功能。　　 2.当阻断腺苷受体A1后，由腺苷A2AR缺失产生的神经保护作用被削弱，激活腺苷受体A1后由腺苷A2A受体缺失产生的神经保护作用被增强。因此我们推测：由阻断腺苷A2AR产生的缺血性神经保护作用与A1R表达增加及功能激活有关。当阻断腺苷A2A受体并同时激活A1受体以后可协同增强这种缺血性神经保护作用。　　 3.腺苷A2AR缺失能增强缺血/再灌注区GLT-1的表达，当阻断腺苷受体A1功能时，这种表达增强的趋势被削弱；当激活腺苷受体A1功能时，这种表达增强的趋势被强化。结合本课题组前期实验发现：腺苷A2A受体基因敲除后能显著减少脑缺血/再灌注区细胞外的谷氨酸浓度，并改善神经功能，由此我们推测：腺苷A2A受体缺失产生的缺血性神经保护功能可能与激活A1R功能并上调GLT-1表达，增加了向细胞内转运谷氨酸能力，从而减轻了由大量谷氨酸堆积介导的兴奋性毒性损伤。　　 4.本研究为腺苷受体在缺血性脑损伤的神经保护方面提供更多的理论基础、为腺苷A2A受体抑制药物及A1受体激活药物的联合用药方案进入临床研究，及为给要时机的选择提供理论依据。