中国甘薯双生病毒种类鉴定、分子变异及检测方法研究

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甘薯是我国重要的粮食作物、食品加工和工业原料及有潜力的能源作物。我国是世界上最大的甘薯生产国。近年来甘薯双生病毒病在我国的发生危害日益加重,严重影响甘薯产业的健康发展。由于我国甘薯双生病毒病一直缺乏系统研究,甘薯双生病毒的种类、分布、分子变异及致病性尚不清楚,导致对这一病害的防控缺乏科学依据。针对上述问题开展了相关研究,取得主要结果如下:1)中国甘暮双生病毒的种类、发生频率及分布:利用PCR和RCA方法对采自全国20多个省(市)的约330份甘薯样品进行了双生病毒的检测。共获得51个甘薯双生病毒基因组(近)全长序列。我国甘薯双生病毒有9个种,包括甘薯曲叶病毒(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV)、甘薯中国曲叶病毒(Sweet potato leaf curl China virus, SPLCCNV)、甘薯乔治亚曲叶病毒(Sweet potato leaf curl Geogia virus, SPLCGoV)3个种,甘薯上海曲叶病毒(Sweet potato leaf curl Shanghai virus, SPLCShV)和甘薯日本曲叶病毒(Sweet potato leaf curl Japan virus, SPLCJV)2个暂定种,以及甘薯中国四川曲叶病毒(Sweet potato leaf curl China Sichuan virus, SPLCCS)、甘薯河南曲叶病毒Sweet potato leaf curl Henan virus (SPLCHnV)、甘薯广西曲叶病毒(Sweet potato leaf curl Guangxi virus, SPLCGxV)和甘薯河南4曲叶病毒(Sweet potato leaf curl Henan4virus, SPLCHn4V)4个新种。SPLCV的发生频率最高,达37.3%;其次为SPLCShV (17.6%), SPLCHn4V和SPLCCNV发生频率分别为11.8%和2.0%,相对较低。甘薯双生病毒在我国三大薯区均有分布,54.9%的阳性样品表现出卷叶症状。2)中国甘暮双生病毒的分子变异:中国甘薯双生病毒51个不同分离物的基因组核酸序列相似性在78.6%-99.9%之间。SPLCV19个分离物核酸序列相似性在91.3%-99.9%之间,种内变异最大;SPLCJV7个分离物的核酸序列相似性在98.7%-99.8%之间,种内变异相对较小。进化树分析显示中国甘薯双生病毒可分为9个分支。中国甘薯双生病毒64个CP基因的核酸序列相似性在84.5%-100%之间,在进化树上聚为两个大的分支。3)甘暮双生病毒4个新种的全序列及重组分析:获得了4个甘薯双生病毒新种的基因组全长序列。SPLCCSV基因组全长2764nts,与SPLCCNV的核酸序列相似性最高(84.8%);重组分析发现SPLCCSV含有由SPLCV-GZ01和SPLCV-Merremia N4重组而来的序列。SPLCHnV基因组全长2766nts,与SPLCCSV的核酸序列相似性最高(89.0%),其AC2、 AC3基因是由SPLCCNV-[CN:05]与SPLCV-CE[BR:Forl]重组而来,非编码区(IR区)含有SPLCBeV和SPLCCNV-ZJ重组而来的序列。SPLCGxV基因组全长2831nts,与SPLCCSV核酸序列相似性最高(88.3%);它含有由SPLCCNV-[Sichuan14:2012]与SPLCShV重组而来的序列。SPLCHn4V基因组全长2826nts,与SPLCCNV核酸序列相似性最高(89.7%),含有由SPLCV-J508, SPLCV-[Guangxi2:2012]和SPLCV重组而来的序列。4)甘暮双生病毒的检测方法研究:①SPLCCSV和SPLCV CP基因的原核表达及抗血清制备;在大肠杆菌中高效表达了SPLCCSV和SPLCV的CP基因,以表达的蛋白为抗原免疫家兔,制备了SPLCCSV和SPLCV两种病毒的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,SPLCCSV抗血清的效价为1:5000,SPLCV抗血清效价为1:2000。两种抗血清均可用于田间甘薯样品的检测。②多重PCR检测方法的建立:通过设计针对SPLCV、 SPLCGoV和SPLCHn4V三种双生病毒的特异性引物,优化多重PCR反应条件,建立了能同时检测这三种甘薯双生病毒的多重PCR方法。该方法能有效区分三种病毒,最低检测拷贝数分别为2.46×104拷贝/μL、1.47×104拷贝/μL和1.58×104拷贝/μL。③基于深度测序技术的甘暮双生病毒检测方法:首次将深度测序技术应用于甘薯双生病毒的检测,通过提取甘薯样品的总DNA,经RCA、构建DNA文库、高通量测序、数据质量控制、病毒片段拼接比对及PCR验证,共检测到7种甘薯双生病毒。5) SPLCCSV侵染性克隆的构建:利用无缝连接技术构建了SPLCCSV的侵染性克隆。农杆菌介导法接种病毒3周后,本氏烟系统叶出现轻微的皱缩、起泡和黄化症状,利用PCR方法从本氏烟的系统叶中检测到了SPLCCSV的存在,初步证明了侵染性克隆SPLCCSV的活性。
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