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目的:考察银花青蒿栀子(Yinhua-Qinghao-Zhizi,YQZ)方抗A6型柯萨奇病毒(Coxsavirus A6,CV-A6)的作用,探讨其药效物质基础,为YQZ用于抗CV-A6的临床应用提供实验依据.建立银花青蒿栀子方灌肠剂(Yinhua-Qinghao-Zhizi enema, YQZE)的制备工艺和质量控制标准,评价其体内外抗CV-A6作用,探讨其作用机制,考察其解热、抗炎和清除毒素作用,阐述YQZE在大鼠体内的药动学特征,开发抗病毒中药新制剂,为清热解毒类中药制成灌肠剂应用提供研究思路.
方法:
1.YQZ醇提物抗CV-A6作用的研究:以CV-A6感染RD细胞为模型,利用CCK8试剂盒检测计算病毒抑制率,RT-qPCR法测定细胞上清中的病毒载量,评价YQZ醇提物体外抗CV-A6作用.10日龄ICR乳鼠随机分为正常对照组、模型对照组、YQZ醇提物高剂量组(生药2.6g·kg-1)、低剂量组(生药1.3g·kg-1)及利巴韦林对照组(10 mg·kg-1),每组14只.除正常对照组外,其余组先感染ipCV-A6病毒液(108.0 TCID50),接毒后1h内给药,每日2次,连续给药14d,模型对照组和正常对照组灌肠给予同体积生理盐水(NS).于第4天每组随机取4只,麻醉后处死,取心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢肌等组织,RT-qPCR法测定组织中病毒载量.余下10只用于统计乳鼠存活率和临床症状评分,末次给药3h后处死剩余动物,采集后肢骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织,加10﹪中性福尔马林固定,HE染色观察组织的病理变化.
2.YQZ醇提物抗CV-A6的药效物质基础研究:采用有机溶剂萃取、硅胶柱层析、大孔吸附树脂等多种方式对YQZ醇提物进行分离纯化,以病毒抑制率为指标,追踪其抗CV-A6活性成分,利用DiscoveryStudio2017软件对有效成分与CV-A6靶点蛋白进行分子对接,分析二者之间的相互作用,探讨其药效物质基础.
3.YQZE的制备和质量控制:
(1)制备:分别建立HPLC-UV法测定绿原酸和栀子苷、青蒿酸、木犀草苷含量的方法学,建立HPLC-ELSD法测定青蒿素含量的方法学.以绿原酸、栀子苷、青蒿酸、青蒿素和木犀草苷的提取量为指标,采用综合加权评分法优化YQZ超声法提取工艺.优化处方中增溶剂的用量、促吸收剂的种类,建立YQZE的制备工艺.
(2)质量控制:采用TLC法定性鉴别YQZE中的金银花、青蒿和栀子,采用HPLC-UV法测定绿原酸、栀子苷、木犀草苷和青蒿酸含量,采用HPLC-ELSD法测定青蒿素含量,建立YQZE的HPLC指纹图谱,对YQZE进行质量控制.
4.YQZE抗病毒作用和作用机制研究:
(1)体外抗病毒作用和作用机制:考察不同处理方式下YQZE对CV-A6抑制率和RD细胞上清中病毒载量,分析药物对病毒复制增殖过程的影响;通过AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡,考察药物对CV-A6诱导RD细胞凋亡的影响.
(2)体内抗病毒作用和作用机制:10日龄ICR乳鼠随机分为正常对照组、模型对照组、YQZE组(生药2.6g·kg-1)及利巴韦林对照组(10 mg·kg-1),每组14只.除正常对照组外,其余组先感染ipCV-A6病毒液(108.0 TCID50),接毒后1h内给药,每日2次,连续给药14d,模型对照组和正常对照组灌肠给予同体积NS.于第4天每组随机取4只,麻醉后内眦取血,ELISA法测定血清中TGF-β的水平,应用ProcartaPlex多因子检测试剂盒测定IL-4、IL-5、IL-6、IL-12p70、TNF-α和IFN-γ的水平;取心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢肌等组织,RT-qPCR法测定组织中病毒载量.余下10只用于统计乳鼠存活率和临床症状评分,末次给药3h后处死剩余动物,采集后肢骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织,加10﹪中性福尔马林固定.HE染色观察骨骼肌等组织器官的病理变化,IHC检测组织中的病毒抗原分布,电镜下观察脊髓组织超微结构的变化,TUNEL法检测骨骼肌组织细胞凋亡.
5.YQZE的解热、抗炎和清除毒素作用:SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、NS灌肠对照组、热毒宁注射液(RDN)对照组和YQZE组,监测大鼠体温变化,评价YQZE的解热作用;根据试剂盒说明书检测给药后4h和8h血清中Cr、TBIL和BUN水平,评价其清除毒素作用;ELISA法测定血清中TNF-α和IL-6水平,评价其抗炎作用.
6.YQZE大鼠体内的药动学研究:采用HPLC法测定大鼠血浆中绿原酸和栀子苷、木犀草苷、青蒿酸浓度,采用DAS软件确定房室模型和药动学参数,考察YQZE中绿原酸、栀子苷、木犀草苷和青蒿酸大鼠体内的药动学特征.
结果:
1.YQZ醇提物抗CV-A6作用的研究:金银花3g、青蒿15g、栀子2g的YQZ方醇提物(浓度相当于生药102.0μg·mL-1)对CV-A6的抑制率为(90.96±2.27)﹪,细胞上清病毒载量拷贝数的对数为5.77±0.30(n=3).模型组ICR乳鼠在14dpi的生存率为10﹪,YQZ醇提物高剂量组和低剂量组的生存率分别为70﹪和60﹪.模型组乳鼠普遍出现双后肢急性弛缓性麻痹(AFP)症状,YQZ醇提物高剂量组和低剂量组AFP等症状均减轻.HE染色切片显示模型组乳鼠骨骼肌肌纤维稀疏、肌束断裂,肺脏出现纤维化,心脏的心肌纤维溶解,脊髓前角部分运动神经元变性坏死.低、高2个剂量的YQZ醇提物均可减轻CV-A6对上述组织导致的病理损伤、降低病毒载量,其中,高剂量组乳鼠骨骼肌、心脏和肺组织中的病毒载量显著降低(P<0.05).
2.YQZ醇提物抗CV-A6的药效物质基础研究:醇提物的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位对CV-A6抑制率均高于对照利巴韦林,石油醚部位分离得到的青蒿酸和青蒿素、乙酸乙酯部位分离得到的木犀草苷、正丁醇部位分离得到的绿原酸和栀子苷对CV-A6抑制率显著高于对照利巴韦林(P<0.01).分子对接结果表明,青蒿素、青蒿酸、绿原酸、栀子苷和木犀草苷分子和CV-A6衣壳蛋白VP1之间存在多个氢键、范德华引力等作用,亲和力大.
3.YQZE的制备和质量控制:
(1)制备:YQZ超声法提取工艺优化的条件为:溶剂为55﹪乙醇、料液比1∶8、超声时间30min、超声频率28KHZ.3﹪吐温-80为增溶剂时,木犀草苷和青蒿酸溶解度分别为112.38μg·mL-1和659.25μg·mL-1.以绿原酸和栀子苷、木犀草苷、青蒿酸的生物利用度为指标,促吸收剂的效果为:氮酮>泊洛沙姆>1,2-丙二醇.以3﹪吐温-80为增溶剂、3﹪氮酮为促吸收剂、0.2﹪山梨酸钾为防腐剂,制得浓度为0.80g(生药)·mL-1的YQZE.
(2)质量控制:以金银花中的木犀草苷、青蒿中的青蒿素和栀子中的栀子苷为指标,进行了YQZE的TLC定性鉴别.YQZE中绿原酸、栀子苷、木犀草苷、青蒿酸和青蒿素的平均含量分别为6.29、6.56、0.112、0.662和0.592mg·mL-1.以乙腈-0.2﹪磷酸为流动相梯度洗脱,建立了YQZE在345nm波长处的HPLC指纹图谱,11批次样品HPLC指纹图谱的整体相似度均大于0.9.
4.YQZE抗病毒作用和作用机制研究:
(1)体外抗病毒作用:与模型组相比,先加药后接毒、药物和病毒混合后加入和先接毒后加药3种处理方式下,YQZE均可显著降低细胞上清中的病毒载量(P<0.01).其中,药物和病毒混合后加入的方式下YQZE的抗病毒活性最好,表明其主要是通过抑制CV-A6对RD细胞的吸附/穿入过程发挥作用.与模型组比,YQZE组的细胞凋亡率显著降低(P<0.01).
(2)体内抗病毒作用:CV-A6感染ICR乳鼠模型组和YQZE组在14dpi的生存率分别为10﹪和70﹪.与模型组比,YQZE组乳鼠AFP等症状减轻,运动能力趋于正常,临床评分低.HE染色切片显示,YQZE组乳鼠骨骼肌纤维和心肌纤维基本整齐,肺脏纤维化程度轻微,延髓和脊髓前角少量运动神经元变性坏死,病理组织损伤较模型组减轻.IHC染色切片显示,模型组乳鼠骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织中均有病毒抗原分布,YQZE组乳鼠上述组织病毒抗原分布均减少.与模型组相比,YQZE组乳鼠的骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织病毒载量显著降低(P<0.05或P<0.01).模型组乳鼠脊髓组织的超微结构发生改变,如前角运动神经元细胞线粒体发生肿胀变形、形成空泡等,YQZE组乳鼠的神经元细胞结构基本正常.与模型组相比,YQZE组乳鼠的骨骼肌细胞凋亡减少,血清中IL-5、IL-6、IL-12p70、TNF-α、IFN-γ和TGF-β水平显著降低(P<0.01).
5.YQZE的解热、抗炎和排毒作用:与模型组相比,YQZE组大鼠在给药后1~8h的体温显著降低(P<0.05或0.01),4h和8h血清中Cr、TBIL、BUN、TNF-α、IL-6水平均显著降低(P<0.01).
6.YQZE大鼠体内的药动学研究:血浆中绿原酸、栀子苷、木犀草苷和青蒿酸分别在1.625~104.0、1.925~123.2、0.6~19.2、0.213~13.6μg·mL-1内线性关系良好,回收率在90~110﹪范围内.YQZE大鼠单次给药后,YQZE大鼠单次给药后,绿原酸、栀子苷、木犀草苷和青蒿酸的药动学符合二室模型,药动学参数AUC分别为7.93、14.15、2.41和18.65mg·h·L-1,Cmax分别为5.85、12.89、1.35和10.50mg·L-1,t1/2α分别为0.18、0.17、0.32和0.30h.
结论:YQZ方具有体内外抗CV-A6作用,药效物质基础主要为绿原酸、栀子苷、青蒿酸、青蒿素和木犀草苷.YQZE的制备工艺简单,质量控制科学、全面,具有确切的体内外抗CV-A6作用,其作用机制与抑制病毒衣壳蛋白VP1、抑制病毒对宿主细胞的吸附/穿入、干预病毒诱导的宿主细胞凋亡和细胞因子风暴等有关.YQZE给药后吸收速度快,生物利用度较高,具有良好的解热、抗炎和清除毒素作用,为其开发成临床应用于抗CV-A6感染的制剂提供了实验依据和研究基础.
方法:
1.YQZ醇提物抗CV-A6作用的研究:以CV-A6感染RD细胞为模型,利用CCK8试剂盒检测计算病毒抑制率,RT-qPCR法测定细胞上清中的病毒载量,评价YQZ醇提物体外抗CV-A6作用.10日龄ICR乳鼠随机分为正常对照组、模型对照组、YQZ醇提物高剂量组(生药2.6g·kg-1)、低剂量组(生药1.3g·kg-1)及利巴韦林对照组(10 mg·kg-1),每组14只.除正常对照组外,其余组先感染ipCV-A6病毒液(108.0 TCID50),接毒后1h内给药,每日2次,连续给药14d,模型对照组和正常对照组灌肠给予同体积生理盐水(NS).于第4天每组随机取4只,麻醉后处死,取心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢肌等组织,RT-qPCR法测定组织中病毒载量.余下10只用于统计乳鼠存活率和临床症状评分,末次给药3h后处死剩余动物,采集后肢骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织,加10﹪中性福尔马林固定,HE染色观察组织的病理变化.
2.YQZ醇提物抗CV-A6的药效物质基础研究:采用有机溶剂萃取、硅胶柱层析、大孔吸附树脂等多种方式对YQZ醇提物进行分离纯化,以病毒抑制率为指标,追踪其抗CV-A6活性成分,利用DiscoveryStudio2017软件对有效成分与CV-A6靶点蛋白进行分子对接,分析二者之间的相互作用,探讨其药效物质基础.
3.YQZE的制备和质量控制:
(1)制备:分别建立HPLC-UV法测定绿原酸和栀子苷、青蒿酸、木犀草苷含量的方法学,建立HPLC-ELSD法测定青蒿素含量的方法学.以绿原酸、栀子苷、青蒿酸、青蒿素和木犀草苷的提取量为指标,采用综合加权评分法优化YQZ超声法提取工艺.优化处方中增溶剂的用量、促吸收剂的种类,建立YQZE的制备工艺.
(2)质量控制:采用TLC法定性鉴别YQZE中的金银花、青蒿和栀子,采用HPLC-UV法测定绿原酸、栀子苷、木犀草苷和青蒿酸含量,采用HPLC-ELSD法测定青蒿素含量,建立YQZE的HPLC指纹图谱,对YQZE进行质量控制.
4.YQZE抗病毒作用和作用机制研究:
(1)体外抗病毒作用和作用机制:考察不同处理方式下YQZE对CV-A6抑制率和RD细胞上清中病毒载量,分析药物对病毒复制增殖过程的影响;通过AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡,考察药物对CV-A6诱导RD细胞凋亡的影响.
(2)体内抗病毒作用和作用机制:10日龄ICR乳鼠随机分为正常对照组、模型对照组、YQZE组(生药2.6g·kg-1)及利巴韦林对照组(10 mg·kg-1),每组14只.除正常对照组外,其余组先感染ipCV-A6病毒液(108.0 TCID50),接毒后1h内给药,每日2次,连续给药14d,模型对照组和正常对照组灌肠给予同体积NS.于第4天每组随机取4只,麻醉后内眦取血,ELISA法测定血清中TGF-β的水平,应用ProcartaPlex多因子检测试剂盒测定IL-4、IL-5、IL-6、IL-12p70、TNF-α和IFN-γ的水平;取心脏、肺脏、脊髓、延髓和后肢肌等组织,RT-qPCR法测定组织中病毒载量.余下10只用于统计乳鼠存活率和临床症状评分,末次给药3h后处死剩余动物,采集后肢骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织,加10﹪中性福尔马林固定.HE染色观察骨骼肌等组织器官的病理变化,IHC检测组织中的病毒抗原分布,电镜下观察脊髓组织超微结构的变化,TUNEL法检测骨骼肌组织细胞凋亡.
5.YQZE的解热、抗炎和清除毒素作用:SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、NS灌肠对照组、热毒宁注射液(RDN)对照组和YQZE组,监测大鼠体温变化,评价YQZE的解热作用;根据试剂盒说明书检测给药后4h和8h血清中Cr、TBIL和BUN水平,评价其清除毒素作用;ELISA法测定血清中TNF-α和IL-6水平,评价其抗炎作用.
6.YQZE大鼠体内的药动学研究:采用HPLC法测定大鼠血浆中绿原酸和栀子苷、木犀草苷、青蒿酸浓度,采用DAS软件确定房室模型和药动学参数,考察YQZE中绿原酸、栀子苷、木犀草苷和青蒿酸大鼠体内的药动学特征.
结果:
1.YQZ醇提物抗CV-A6作用的研究:金银花3g、青蒿15g、栀子2g的YQZ方醇提物(浓度相当于生药102.0μg·mL-1)对CV-A6的抑制率为(90.96±2.27)﹪,细胞上清病毒载量拷贝数的对数为5.77±0.30(n=3).模型组ICR乳鼠在14dpi的生存率为10﹪,YQZ醇提物高剂量组和低剂量组的生存率分别为70﹪和60﹪.模型组乳鼠普遍出现双后肢急性弛缓性麻痹(AFP)症状,YQZ醇提物高剂量组和低剂量组AFP等症状均减轻.HE染色切片显示模型组乳鼠骨骼肌肌纤维稀疏、肌束断裂,肺脏出现纤维化,心脏的心肌纤维溶解,脊髓前角部分运动神经元变性坏死.低、高2个剂量的YQZ醇提物均可减轻CV-A6对上述组织导致的病理损伤、降低病毒载量,其中,高剂量组乳鼠骨骼肌、心脏和肺组织中的病毒载量显著降低(P<0.05).
2.YQZ醇提物抗CV-A6的药效物质基础研究:醇提物的石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位对CV-A6抑制率均高于对照利巴韦林,石油醚部位分离得到的青蒿酸和青蒿素、乙酸乙酯部位分离得到的木犀草苷、正丁醇部位分离得到的绿原酸和栀子苷对CV-A6抑制率显著高于对照利巴韦林(P<0.01).分子对接结果表明,青蒿素、青蒿酸、绿原酸、栀子苷和木犀草苷分子和CV-A6衣壳蛋白VP1之间存在多个氢键、范德华引力等作用,亲和力大.
3.YQZE的制备和质量控制:
(1)制备:YQZ超声法提取工艺优化的条件为:溶剂为55﹪乙醇、料液比1∶8、超声时间30min、超声频率28KHZ.3﹪吐温-80为增溶剂时,木犀草苷和青蒿酸溶解度分别为112.38μg·mL-1和659.25μg·mL-1.以绿原酸和栀子苷、木犀草苷、青蒿酸的生物利用度为指标,促吸收剂的效果为:氮酮>泊洛沙姆>1,2-丙二醇.以3﹪吐温-80为增溶剂、3﹪氮酮为促吸收剂、0.2﹪山梨酸钾为防腐剂,制得浓度为0.80g(生药)·mL-1的YQZE.
(2)质量控制:以金银花中的木犀草苷、青蒿中的青蒿素和栀子中的栀子苷为指标,进行了YQZE的TLC定性鉴别.YQZE中绿原酸、栀子苷、木犀草苷、青蒿酸和青蒿素的平均含量分别为6.29、6.56、0.112、0.662和0.592mg·mL-1.以乙腈-0.2﹪磷酸为流动相梯度洗脱,建立了YQZE在345nm波长处的HPLC指纹图谱,11批次样品HPLC指纹图谱的整体相似度均大于0.9.
4.YQZE抗病毒作用和作用机制研究:
(1)体外抗病毒作用:与模型组相比,先加药后接毒、药物和病毒混合后加入和先接毒后加药3种处理方式下,YQZE均可显著降低细胞上清中的病毒载量(P<0.01).其中,药物和病毒混合后加入的方式下YQZE的抗病毒活性最好,表明其主要是通过抑制CV-A6对RD细胞的吸附/穿入过程发挥作用.与模型组比,YQZE组的细胞凋亡率显著降低(P<0.01).
(2)体内抗病毒作用:CV-A6感染ICR乳鼠模型组和YQZE组在14dpi的生存率分别为10﹪和70﹪.与模型组比,YQZE组乳鼠AFP等症状减轻,运动能力趋于正常,临床评分低.HE染色切片显示,YQZE组乳鼠骨骼肌纤维和心肌纤维基本整齐,肺脏纤维化程度轻微,延髓和脊髓前角少量运动神经元变性坏死,病理组织损伤较模型组减轻.IHC染色切片显示,模型组乳鼠骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织中均有病毒抗原分布,YQZE组乳鼠上述组织病毒抗原分布均减少.与模型组相比,YQZE组乳鼠的骨骼肌、脊髓、延髓、心脏和肺组织病毒载量显著降低(P<0.05或P<0.01).模型组乳鼠脊髓组织的超微结构发生改变,如前角运动神经元细胞线粒体发生肿胀变形、形成空泡等,YQZE组乳鼠的神经元细胞结构基本正常.与模型组相比,YQZE组乳鼠的骨骼肌细胞凋亡减少,血清中IL-5、IL-6、IL-12p70、TNF-α、IFN-γ和TGF-β水平显著降低(P<0.01).
5.YQZE的解热、抗炎和排毒作用:与模型组相比,YQZE组大鼠在给药后1~8h的体温显著降低(P<0.05或0.01),4h和8h血清中Cr、TBIL、BUN、TNF-α、IL-6水平均显著降低(P<0.01).
6.YQZE大鼠体内的药动学研究:血浆中绿原酸、栀子苷、木犀草苷和青蒿酸分别在1.625~104.0、1.925~123.2、0.6~19.2、0.213~13.6μg·mL-1内线性关系良好,回收率在90~110﹪范围内.YQZE大鼠单次给药后,YQZE大鼠单次给药后,绿原酸、栀子苷、木犀草苷和青蒿酸的药动学符合二室模型,药动学参数AUC分别为7.93、14.15、2.41和18.65mg·h·L-1,Cmax分别为5.85、12.89、1.35和10.50mg·L-1,t1/2α分别为0.18、0.17、0.32和0.30h.
结论:YQZ方具有体内外抗CV-A6作用,药效物质基础主要为绿原酸、栀子苷、青蒿酸、青蒿素和木犀草苷.YQZE的制备工艺简单,质量控制科学、全面,具有确切的体内外抗CV-A6作用,其作用机制与抑制病毒衣壳蛋白VP1、抑制病毒对宿主细胞的吸附/穿入、干预病毒诱导的宿主细胞凋亡和细胞因子风暴等有关.YQZE给药后吸收速度快,生物利用度较高,具有良好的解热、抗炎和清除毒素作用,为其开发成临床应用于抗CV-A6感染的制剂提供了实验依据和研究基础.