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马兜铃酸肾病(AAN)呈急慢性演化进程。急性马兜铃酸肾病中,马兜铃酸主要损伤近端肾小管上皮细胞(PTEC),肾小管上皮细胞凋亡构成急性AAN发病机制中主要的细胞死亡途径。既往研究证实p53通路参与马兜铃酸诱导的肾小管上皮细胞凋亡过程。同源盒基因Six1是转录调控因子,在细胞发育、增殖、分化、凋亡中发挥作用,同时也参与调控细胞周期,在细胞生长和增殖中起重要作用。已有报道表明Six1可负性调控p53,并且不依赖于p53泛素化降解蛋白MDM2起作用。如果在急性AAN模型中过表达Six1,是否可以通过调控p53减少肾小管上皮细胞凋亡?因此,本课题旨在研究Six1基因通过调控p53通路在急性马兜铃酸肾病中的保护作用及相关机制。首先,在体内实验中,我们采用腹腔注射马兜铃酸(AAI)的方式建立急性马兜铃酸肾病小鼠模型,发现肾小管上皮细胞凋亡增加,同时肾脏组织中Six1的表达减少,p53、p-p53及凋亡相关蛋白cleaved-caspase3(c-caspase3)表达增加。然后运用腺相关病毒(AAV9)肾包膜下局部注射的方式构建肾脏Six1过表达小鼠模型,模型成功后,在此基础上建立急性马兜铃酸肾病小鼠模型。我们观察到,与对照组相比随着Six1的表达水平增加,p53及c-caspase3表达减少,相应肾脏细胞凋亡数目减少,组织损伤减轻。在体外实验则中,我们用10ug/mL马兜铃酸刺激大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),细胞凋亡明显增加,肾小管上皮细胞Six1表达减少,同时p53、p-p53、c-caspase3表达增加。利用腺病毒过表达技术将肾小管上皮细胞中的Six1基因过表达后,马兜铃酸刺激肾小管上皮细胞表达的p53、p-p53及c-caspase3减少,细胞凋亡减少。综上所述,Six1可下调p53表达,从而抑制凋亡相关通路,最终减少马兜铃酸诱导的肾小管上皮细胞凋亡。因此,上调Six1基因表达水平有望成为临床治疗急性马兜铃酸肾病的新策略。第一部分Six1在急性马兜铃酸肾病中的表达目的:探讨Six1在急性马兜铃酸肾病中的表达变化。方法:首先查询肾脏基因表达数据库Nephromine(https://www.nephroseq.org)明确Six1在人类肾脏疾病中表达变化。然后利用腹腔注射马兜铃酸方式构建小鼠急性马兜铃酸肾病模型,将实验动物分为2组:(1)假手术组(Sham):腹腔注射生理盐水;(2)模型组(AAN):腹腔注射马兜铃酸;予AAI(20mg/kg)一次性腹腔注射诱导急性AAN,分别在AAI注射第1、3、7天处死小鼠,取血清检测肌酐、尿素等肾功能变化,PAS染色观察肾小管损伤程度,免疫组化染色观察Six1表达水平及定位,TUNEL染色观察肾小管上皮细胞凋亡改变。应用Western blot和real-time PCR检测肾脏Six1、p53、p-p53及c-caspase-3等表达变化。结果:CKD患者肾脏中Six1表达明显下降。在急性AAN模型中,与假手术组相比,肾小管中Six1表达明显下降,肾小管上皮细胞凋亡增加,同时肾脏中p53、p-p53及凋亡相关蛋白c-caspase3(cleaved-caspase3)表达增加,Six1表达变化与p53、p-p53及凋亡相关蛋白c-caspase3表达变化呈负相关。结论:在急性马兜铃酸肾病模型中,Six1表达减少伴随肾小管上皮细胞凋亡增加,Six1表达水平异常和马兜铃酸肾病发展有关。第二部分Six1在急性AAN中通过抑制p53介导的PTEC凋亡减轻肾脏损伤目的:探讨Six1在急性马兜铃酸肾病中的保护作用及机制。方法:利用马兜铃酸腹腔注射方式构建急性马兜铃酸肾病小鼠模型,用Six1过表达腺相关病毒(AAV9)肾包膜局部注射的方式构建肾脏Six1过表达小鼠模型,将实验动物分为2组:(1)空载病毒+AAN模型组(Vehicle+AAI):肾包膜下注射空载病毒+马兜铃酸腹腔注射;(2)肾包膜下注射Six1过表达病毒+马兜铃酸腹腔注射。病毒感染21天后予AAI(20mg/kg)一次性腹腔注射诱导急性AAN,分别在AAI注射第1,3,7天处死小鼠,取血清检测肌酐、尿素等肾功能变化,PAS染色观察肾小管损伤程度,TUNEL染色检测肾小管上皮细胞凋亡变化。Real-time PCR检测Six1 m RNA水平改变,Western blot检测肾组织Six1、p53、p-p53及c-caspase-3蛋白表达水平变化。结果:在急性AAN动物模型中,与空载组相比,肾脏Six1过表达组肾小管上皮细胞凋亡数明显减少,肾脏病理损伤减轻,p53、p-p53及凋亡相关蛋白c-caspase-3表达减少,但是两组肾功能改变无统计学差异。结论:在急性马兜铃酸肾病模型中,过表达Six1基因可通过下调p53减轻马兜铃酸诱导的肾小管上皮细胞凋亡而减轻肾脏病理损伤。第三部分Six1在马兜铃酸诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用与机制研究目的:探索Six1在马兜铃酸诱导肾小管上皮细胞损伤中的作用机制。方法:在体外实验中,用AAI刺激大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E),并设置AAI浓度梯度及时间梯度,利用Real-time PCR检测Six1 m RNA水平改变,Western Blot检测Six1和p53、p-p53、c-caspase3的蛋白表达水平。利用过表达Six1腺病毒转染NRK-52E细胞,转染成功后加入AAI刺激,流式细胞术检测细胞凋亡变化,Western blot检测Six1、p53、p-p53、MDM2及凋亡相关蛋白c-caspase-3表达水平。结果:AAI刺激NRK-52E细胞,随着AAI浓度的提高,刺激时间的延长,Six1表达减少,p53及p-p53蛋白表达量逐渐增多;过表达Six1基因后,与空载病毒组相比,AAI刺激诱导的NRK-52E细胞凋亡减少,p53、p-p53、c-caspase-3等蛋白表达减少。与对照组相比,MDM2蛋白水平无变化。结论:Six1可减轻p53介导的AAI诱导的肾小管上皮细胞损伤。