[研究背景]妊娠期高血压疾病(hypertensive disorders complicating pregnancy,HDCP)是妊娠与血压升高相并存的一组疾病,我国的发病率为9.4%-10.4%,其中2%-7%为子痫前期(preeclampsia,PE),该组疾病严重地影响母婴健康,为孕产妇和围产儿病死率升高的主要原因,PE是发展中国家孕产妇死亡原因第二位。PE是妊娠期高血压疾病的严重状态,其可导致脑出血、脑水肿、心力衰竭、肺水肿、肝破裂、胎盘早剥、凝血功能障碍等严重的并发症,并且增加妇女产后远期罹患心脑血管疾病的风险性；其对胎儿的主要影响是可以导致胎盘功能下降,胎儿生长受限,胎儿窘迫和医源性早产等。对于子痫前期孕妇,特别是早发型重度子痫前期,不仅给产科、儿科医生带来临床难题,也同时影响母婴的远期生存质量,除终止妊娠外,目前尚无明确有效的临床治疗方法。近年有研究报道,对于高危人群,在妊娠16周之前若能预防性地使用小剂量的阿司匹林则可使早发型子痫前期的发病率和围产期死亡率显著降低。实现子痫前期的早期预测对于早防早治及降低母婴死亡率有重要的意义,其预测一直以来都是产科领域的热点和难点,理想的预测试验应该是灵敏度高、假阳性率低、非侵入性、简单、快速、经济以及可重复,但是迄今为止,尚无有效、可靠并且经济的预测方法。因此,探寻与子痫前期的发病有关联的灵敏度与特异性均高并且可以在临床上普遍推广和应用的生物标记物以及筛查方法,将可以有助于尽早地筛查出子痫前期的高危人群,在出现子痫前期的临床症状之前,立即给予合理和有效的临床干预处理,这将可有效地降低母婴病死率以及改善母婴的预后。由于子痫前期的发生,不仅存在着其发生的基础,同时也存在着诱发的始动因素,而且又有妊娠期间不良环境的促发影响因素,因此,预测以及筛查子痫前期的目的是为了早期预防以及早期发现其发生发展,争取将子痫前期的预测工作和首次产前检查联合起来,关注个体患者对于疾病的发生发展趋势并且及时给予干预措施,采取相应的预防以及监控手段,降低或者延缓子痫前期以及重度子痫前期发生。迄今为止,关于子痫前期的病因以及发病机制尚未完全的阐明。目前关于子痫前期的病因主要有以下几种学说：子宫螺旋小动脉重铸不足、血管内皮细胞受损、炎症免疫过度激活、营养缺乏、遗传因素和胰岛素抵抗。有学者提出关于子痫前期发病机制的“两阶段”学说[4],第一阶段是临床前期,这一阶段子宫螺旋动脉的重铸障碍,导致胎盘缺血、缺氧,以致释放多种胎盘因子；第二阶段是胎盘因子进入母体的血液循环,对系统性炎症反应的激活以及血管内皮的损伤起促进作用,导致出现子痫前期、子痫的各种临床症状。因此,应该在第一阶段即临床症状出现之前来预测子痫前期的发生。随着研究不断的深入,越来越多的证据均显示,内皮细胞的损伤以及功能障碍为子痫前期-子痫发病的核心,其直接或间接地致使血管内皮细胞损伤和血管细胞因子合成的障碍,血管内皮损伤后引起血管的渗透性增加、组织缺氧、血液浓缩,凝血因子水平出现增高,抗凝蛋白纤溶因子的水平降低,造成凝血系统与纤溶系统失去动态的平衡,更容易导致出现子宫微循环障碍,造成胎盘缺血和缺氧,患者最终出现高血压、蛋白尿以及水肿等子痫前期的临床表现。正常情况下,体内凝血系统是处于动态平衡之中,能够维持血液在血管内呈流动的状态,一旦这种平衡被破坏,就会造成血栓形成或者出血。凝血功能的改变是PE发病机制中重要的环节,在正常的妊娠妇女处于相对的高凝状态的基础之上,PE患者更具血栓形成的倾向,重度子痫前期的高凝的状态已经被许多临床研究证实,这是凝血和抗凝、纤溶机制、血小板激活以及血管内皮损伤共同作用的结果,有许多指标可以检测其高凝的状态。因此,通过检测血栓前的状态及凝血功能的改变可能预测PE的发生。为了实现对子痫前期早期的预测、预防、诊断以及治疗,国内外的学者对于子痫前期的早期预测做了大量研究工作。随着对子痫前期的病因以及发病机制的认识的不断深化,采用单项的指标预测PE的发病,均难以达到理想的预测效果,美国和加拿大的产科指南中有关PE的预测的方法,均推荐联合多项指标来进行综合的评估。近年来,对于能够预测子痫前期发生的生物标记物的规律性所进行的探讨,已逐渐从妊娠中期20周左右转移至妊娠早期,这更加接近子痫前期发病的初始阶段,以便做好早期预测与预防。越来越多的证据均表明,孕妇血液循环中的促血管生成因子(胎盘生长因子,placental growth factor, PIGF)以及抗血管生成因子(可溶性血管内皮生长因子受体-1,soluble fins-like tyrosine kinase-1, sFlt-1)两者之间的平衡失衡和子痫前期的发病有着密切的关系。sFlt-1/PIGF的比值能够反映血管内皮的功能状态,当妊娠中期sFlt-1/PIGF比值以85为界限时,预测子痫前期发生的最高灵敏度可达82%,特异性达95%。在子痫前期患者中,sFlt-1水平的升高与PIGF水平的降低的这种变化可以明显的提前至妊娠13-16周,这对于子痫前期的预测有较大的意义。研究认为,由于25-羟基维生素D(25-hydroxyvitamin D,25-OH-VD)的活化形式1,25二羟基维生素D能够明显地抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)诱导的内皮细胞萌芽与血管形成,推测母体血清中25-羟基维生素D的低水平可能与VEGF的减少相关,从而导致子痫前期发生,提示孕期母体维生素D缺乏可能为PE独立的危险因素。妊娠期血液的高凝状态并且具有血栓形成倾向而导致的血栓前状态和凝血功能的改变与子痫前期的发生密切相关,一些血栓前状态和凝血功能改变的指标的异常可预示子痫前期的发生。传统的凝血功能的检查如凝血酶原时间、部分凝血活酶时间、纤维蛋白和血小板均不能敏感的反映血栓前状态。D-二聚体(D-dimer)、血管性假血友病因子(von Willebrand factor,vWF)和P-选择素(P-selectin)被认为是检测血栓前状态最重要的指标。由于有些指标可能存在相关性,一些指标联合筛查并不能增加对PE的预测能力,这就提示应将所有有潜力的指标纳入同一个研究,以便确定最佳筛查组合。目前,国内外还没有任何一项研究同时囊括sFlt-1、PIGF、25-羟基维生素D、D-二聚体、vWF和P-选择素这六个指标。[目的和意义]本研究通过对2009年至2013年在南方医科大学附属深圳妇幼保健院分娩的妊娠期高血压疾病患者进行临床流行病学分析,探讨妊娠期高血压疾病的发病情况及对孕产妇及围产儿的影响；同时通过酶联免疫吸附试验来检测妊娠早期(10-13+6周)母体外周血中sFlt-1、PIGF、25-羟基维生素D、D-二聚体、vWF和P-选择素在正常妊娠组与子痫前期组的表达差异,探查这些指标和子痫前期的相关性,并且同时评价这些指标单独以及联合应用对子痫前期的早期预测价值,通过对妊娠期高血压疾病的充分认识,以期望能为子痫前期的早期临床预测、预防以及治疗提供可靠的依据,以便实现对妊娠期高血压疾病的早发现、早治疗及预防,期望达到降低妊娠期高血压疾病患者的严重并发症发生率并使围产儿获得理想结局的效果。[材料与方法]1.材料来源：对2009年至2013年在南方医科大学附属深圳妇幼保健院分娩的妊娠期高血压疾病患者进行回顾性分析,同时选择2013年1月至2013年12月期间孕10-13+6周健康并准备在南方医科大学附属深圳妇幼保健院完成产检和分娩的1081名单胎孕妇作为研究对象,采血孕周10-13+6周,平均采血孕周(12.18±0.86)周。随访妊娠结局,根据妊娠结局,发生子痫前期者作为病例组,共50例,其中轻度子痫前期20例,重度子痫前期30例,年龄20-38岁,平均年龄分别为(30.00±4.61)岁、(29.70±4.34)岁,平均分娩孕周分别为(38.83±1.08)周、(37.70±1.54)周。未发生子痫前期者为对照组,并从中选取同期无妊娠并发症以及合并症的正常妊娠孕妇352例作为对照组研究对象来进行外周血指标检测,年龄20-39岁,平均年龄(28.96±4.08)岁,平均分娩孕周(39.37±0.96)周。三组孕妇平均年龄及孕产次相比较,差异无统计学意义(P>0.05),重度子痫前期组孕妇平均分娩孕周及新生儿出生体重与正常组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。研究对象在孕10～13+6周抽取肘静脉血8ml。其中4ml,注入不抗凝的玻璃试管中,待其自然凝固30mmin后,4℃3000转／分(rpm)离心10分钟,血清分离后分装3管,置-80℃冰箱保存,以待检测sFlt-1、PIGF和25-羟基维生素D；另外4ml,枸橼酸钠抗凝,4℃3000转/分(rpm)离心10分钟,血浆分离后分装3管,置-80℃冰箱保存,以待检测D-二聚体、vWF和P-选择素。并随访妊娠结局,根据妊娠结局,发生子痫前期者为病例组,未发生子痫前期者为对照组,并从中选取同期无妊娠并发症以及合并症的正常妊娠孕妇352例作为对照组研究对象来进行外周血指标检测。实验所选病例均为单胎妊娠,除外了慢性高血压、心脏病、肾病、糖尿病、甲状腺功能亢进、结缔组织病、血液病等慢性病史,无免疫治疗及输血史,孕期无特殊用药史。2.实验方法①对孕妇的发病情况,一般情况(年龄、住院天数及分娩方式等),母儿情况等临床因素进行统计学分析。②将样品置于室温解冻以后,将样品置于4℃冷冻高速离心机,3000转／分,离心2分钟,取上清液用于实验分析。采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测对照组和病例组外周血sFlt-1、PIGF、25-羟基维生素D、D-二聚体、vWF及P-选择素的浓度。实验严格按照试剂盒提供的说明书操作要求进行；OD值的结果判定以酶标仪读数为准。3.统计学处理：采用Excel软件及SPSS13.0统计软件来进行数据处理,计数资料的各组间指标的比较采用χ2检验,计量资料以均数±标准差(X±s)表示,两样本均数的比较采用两独立样本的t检验,多组均数间两两比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。将数据换算成中值倍(multiple of the median,MoM)后,应用Logistic回归分析和受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic,ROC)特征来评价各个指标单独以及联合应用对于子痫前期的预测价值。检验水准a=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1.2009年1月～2013年12月,我院共有78578例分娩,其中妊娠期高血压疾病患者总例数为2486例,其总发生率为3.2%。对妊娠期高血压疾病患者的一般情况进行比较得出：其分娩方式仍然以剖宫产为主,孕妇的年龄及平均住院天数的差异无统计学意义,其中流动人口所占比例较高。对其母儿情况进行比较得出：妊娠期高血压疾病严重并发症的构成比由高到低依次是：产后出血、胎盘早剥、HELLP综合征、心功能不全、弥散性血管内凝血、急性肾衰竭、脑血管意外;其围产儿严重并发症的构成比由高到低依次为：早产、胎儿生长受限、新生儿窒息、死胎、流产。2.1正常组(n=352)与子痫前期组(n=50)的血清sFlt-1水平分别为(1004.10±456.15) pg/ml、(1456.12±253.34) pg/ml,两组差异具有统计学意义(P<0.05),子痫前期组的血清sFlt-1水平高于正常妊娠对照组。2.2正常组(n=352)与子痫前期轻度组(n=20)及子痫前期重度组(n=30)的血清sFlt-1水平分别为(1004.10±456.15) pg/ml、(1293.10±266.75) pg/ml、(1564.80±176.86)pg/ml,三组比较组间的差异有统计学意义(P<0.05)。3.1正常组(n=352)与子痫前期组(n=50)的血清PIGF水平分别为(56.37±11.10)pg/ml、(40.77±10.59)pg/ml,两组差异具有统计学意义(P<0.05),子痫前期组的血清PIGF水平低于正常妊娠对照组。3.2正常组(n=352)与子痫前期轻度组(n=20)及子痫前期重度组(n=30)的血清PIGF水平分别为(56.37±11.10)pg/ml、(48.18+10.85)pg/ml、(35.83±7.03)pg/ml,三组比较组间的差异有统计学意义(P<0.05)。4.1正常组(n=352)与子痫前期组(n=50)的血清sFlt-1/PIGF比值分别为(21.20±20.75)、(38.39±13.71),两组差异具有统计学意义(P<0.05),子痫前期组的血清：sFlt-1/PIGF比值高于正常妊娠对照组。4.2正常组(n=352)与子痫前期轻度组(n=20)及子痫前期重度组(n=30)的血清sFlt-1/PIGF比值分别为(21.20±20.75)、(27.32±4.66)、(45.78±12.75),三组比较组间的差异有统计学意义(P<0.05)。5.1正常组(n=352)与子痫前期组(n=50)的血清25-OH-VD水平分别为(34.12±6.54)ng/ml、(22.86±9.71)ng/ml,两组差异具有统计学意义(P<0.05),子痫前期组的血清25-OH-VD水平低于正常妊娠对照组。5.2正常组(n=352)与子痫前期轻度组(n=20)及子痫前期重度组(n=30)的血清25-OH-VD水平分别为(34.12±6.54)ng/ml、(32.44±7.45)ng/ml、(16.48±4.21)ng/ml,三组比较组间的差异有统计学意义(P<0.05)。6.1正常组(n=352)与子痫前期组(n=50)的血浆vWF水平分别为(872.96±293.36)U/L.(1309.90±308.63) U/L,两组差异具有统计学意义(P<0.05),子痫前期组的血浆vWF水平高于正常妊娠对照组。6.2正常组(n=352)与子痫前期轻度组(n=20)及子痫前期重度组(n=30)的血浆vWF水平分别为(872.96±293.36)U/L、(1162.94±420.61) U/L、(1407.88±142.17)U/L,三组比较组间的差异有统计学意义(P<0.05)。7.1正常组(n=352)与子痫前期组(n=50)的血浆D-二聚体水平分别为(275.52±173.79)ng/ml、(522.68±135.03)ng/ml,两组差异具有统计学意义(P<0.05),子痫前期组的血浆D-二聚体水平高于正常妊娠对照组。7.2正常组(n=352)与子痫前期轻度组(n=20)及子痫前期重度组(n=30)的血浆D-二聚体水平分别为(275.52±173.79)ng/ml、(452.42±184.75)ng/ml、(569.53±52.63)：ng/ml,三组比较组间的差异有统计学意义(P<0.05)。8.1正常组(n=352)与子痫前期组(n=50)的血浆P-选择素水平分别为(93.21±40.47)ng/ml、(150.39±29.87)ng/ml,两组差异具有统计学意义(P<0.05),子痫前期组的血浆P-选择素水平高于正常妊娠对照组。8.2正常组(n=352)与子痫前期轻度组(n=20)及子痫前期重度组(n=30)的血浆P-选择素水平分别为(93.21±40.47)ng/ml、(134.73±39.91)ng/ml、(160.83±13.51)ng/ml,三组比较组间的差异有统计学意义(P<0.05)。9.血清sFlt-1、PIGF、sFlt-1/PIGF、25-羟基维生素D及血浆vWF、D-二聚体、P-选择素的中值倍(MoM)的ROC曲线下面积(AUC)依次为：0.813(95%CI,0.761～0.865,P<0.05);0.861(95%CI,0.804～0.919, P<0.05);0.884(95%CI,0.848～0.920, P<0.05);0.810(95%CI,0.740～0.881, P<0.05);0.837(95%CI,0.760～0.915, P<0.05);0.850(95%CI,0.782～0.917, P<0.05);0.851(95%CI,0.786～0.916,P<0.05)。10.经Logistic回归分析得出几个指标的中值倍(MoM)联合后的ROC曲线特征：①血清sFlt-1、PIGF与25-OH-VD联合后的ROC曲线下面积为0.866(95%CI,0.822～0.909,P<0.05),灵敏度是62%,特异性为90.6%。②血清sFlt-1/PIGF与25-OH-VD联合后的ROC曲线下面积为0.773(95%CI,0.683～0.863,P<0.05),灵敏度是64%,特异性为93.7%。③血浆vWF、D-二聚体及P-选择素联合后的ROC曲线下面积为0.861(95%CI,0.800～0.922,P<0.05),灵敏度是64%,特异性为90.6%。④血清sFlt-1.血浆P-选择素联合后的ROC曲线下面积为0.923(95%CI,0.873～0.973,P<0.05),灵敏度是92%,特异性为90.6%。⑤血清sFlt-1/PIGF、血浆P-选择素联合后的ROC曲线下面积为0.919(95%CI,0.861～0.976,P<0.05),灵敏度是84%,特异性为90.6%。⑥血清sFlt-1/PIGF、血浆D-二聚体及P-选择素联合后的ROC曲线下面积为0.919(95%CI,0.862～0.977,P<0.05),灵敏度是70%,特异性为93.7%。⑦血清sFlt-1、PIGF、血浆D-二聚体及P-选择素联合后的ROC曲线下面积为0.942(95%CI,0.889～0.994,P<0.05),灵敏度是94%,特异性为90.6%。⑧血清sFlt-1、PIGF、25-OH-VD、血浆vWF、D-二聚体及P-选择素联合后的ROC曲线下面积为0.959(95%CI,0.930～0.989,P<0.05),灵敏度是78%,特异性为100%。⑨血清sFlt-1/PIGF、25-OH-VD、血浆vWF、D-二聚体及P-选择素联合后的ROC曲线下面积为0.918(95%CI,0.869～0.967,P<0.05),灵敏度是92%,特异性为84.4%。[结论]1.妊娠期高血压疾病仍是威胁孕产妇以及围产儿健康的严重疾病,我院妊娠期高血压疾病的发生率较低,剖宫产分娩仍然是妊娠期高血压疾病孕妇的主要分娩方式,其在流动人口中的发生率较高；产后出血、胎盘早剥、早产以及胎儿生长受限仍然是妊娠期高血压疾病孕妇与围产儿的主要并发症。因此,需增强围产期保健,重视对妊娠期高血压疾病合并产后出血、胎盘早剥、早产及胎儿生长受限的防治,尤其是着力探寻有效、敏感、简便的预测指标以利于患者能够得到早期预防和治疗进而达到改善妊娠结局的效果。2.sFlt-1、PIGF、25-羟基维生素D、D-二聚体、vWF、P-选择素可能参与了子痫前期的发病机制,除vWF外,其他标记物的水平变化均与子痫前期的病情严重程度有关,提示这些因子能作为检测患者病情变化的生物指标。3.血管内皮损伤及功能障碍可导致凝血系统与纤溶系统失去动态平衡,而凝血功能的改变及血栓前状态可导致并加重母体血管内皮细胞的损伤及功能障碍,两者可能共同参与了子痫前期的发病过程。4.子痫前期组sFlt-1水平明显高于对照组,PIGF水平明显低于正常对照组,而sFlt-1/PIGF比值明显高于对照组,推测机体sFlt-1和PIGF的调节失衡可能参与子痫前期的发病过程,子痫前期患者体内sFlt-1和PIGF二者之间可能存在着恶性循环。5.孕妇血清25-羟基维生素D水平的降低与子痫前期的发病相关,可能预示着子痫前期患病的风险性,孕妇血清25-羟基维生素D水平的降低可能是子痫前期独立的危险因素,对于子痫前期有一定的预测价值。6.凝血系统功能的紊乱可以先于临床症状的出现之前而发生,凝血功能改变及血栓前状态的指标如血浆D-二聚体、vWF、P-选择素,与子痫前期发病可能具有相关性,是预测子痫前期的有潜力的标志物。7.多因子联合检测可以提高对于子痫前期的预测价值,据此,也进一步说明子痫前期发病机制的复杂性。