论文部分内容阅读
新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）所引发的一种严重危害世界养禽业的传染病,可分为强毒株、中毒株和弱毒株三种毒株,其中强毒株可100%致死感染家禽。NDV上的血凝素-神经氨酸酶（HN）蛋白和融合（F）蛋白均是位于病毒粒子囊膜表面的糖蛋白,它们的相互作用是发挥膜融合形成合胞体的关键。而HN蛋白在NDV的生命周期中主要发挥受体结合、促膜融合、神经氨酸酶（NA）活性,已有研究表明,NDV的致病性和膜融合与HN蛋白有关。本实验室前期从野鸟体内分离的两株NDV（NDV-Blackbird和NDV-Dove）同源性极高,F蛋白序列完全相同且裂解基序均为112R-R-Q-R-R↓F117（强毒株和中毒株的裂解基序）,HN蛋白上仅有5个氨基酸突变（AAs:54、110、116、469与522）,但毒力测定发现NDV-Blackbird是强毒,NDV-Dove是弱毒,而且它们在细胞上产生的合胞体大小差异显著。为了探究这5个氨基酸变异对两株NDV膜融合活性的影响及影响途径,本论文从以下几方面展开研究:1. 两株NDV的生物活性分析将两株NDV分别感染BHK21细胞24 h后,通过Image J软件分别统计它们所产生的40个合胞体的直径用以比较膜融合活性的差异,发现NDV-Blackbird产生的合胞体明显大于NDV-Dove。通过蚀斑法测定接毒后不同时间点的病毒滴度来检测它们在DF-1细胞中的增殖情况,发现NDV-Blackbird的增殖速度明显快于NDV-Dove。同时,在感染BHK21细胞24 h后,利用血吸附（HAd）试验和神经氨酸酶（NA）检测试剂盒分别检测了它们的受体结合和神经氨酸酶活性,发现NDV-Blackbird的受体结合和神经氨酸酶活性均明显高于NDV-Dove。综上所述,研究结果表明,两株NDV膜融合活性的差异可能与增殖能力差异和HN蛋白功能活性差异相关。2. 两株NDV的HN蛋白差异位点分析通过统计两株NDV编码结构蛋白中的差异氨基酸,并利用Py MOL软件分别构建HN蛋白的三维结构模型,对HN蛋白上差异氨基酸的位置进行了分析。同时,收集Gen Bank中裂解基序均为112R/K-R-Q-R/K-R↓F117的763株NDV的序列信息,利用Lasergene7.1软件分析它们的完整HN蛋白序列,确定了5个位置的主要氨基酸种类。研究表明,5个氨基酸突变分别位于HN蛋白的不同位置,这些氨基酸的突变发生在主要氨基酸之间。3. HN突变体蛋白的细胞膜表面表达效率分析将HN突变体和野生型质粒转染进BHK21细胞24 h后,通过间接免疫荧光（IIFA）和流式细胞术（FCM）对HN突变体蛋白的表达水平和细胞膜表面表达效率分析后发现,所有的HN突变体和野生型蛋白均成功表达,且在细胞膜表面的表达效率没有显著差异。4. HN突变体蛋白的生物活性分析为了排除病毒增殖能力对膜融合活性的影响,利用融合PCR技术构建5个HN单突变体质粒,将其HN突变体和野生型质粒分别与F质粒共转染BHK21细胞36 h后,通过Image J软件分别统计它们所产生的40个合胞体的面积用以比较促膜融合活性的差异,发现NDV-Blackbird的HN蛋白比NDV-Dove拥有更强的促膜融合能力,而突变体中T522I没有影响,G54S、F110L、G116R和A469V具有不同程度的影响,其中F100L和G116R影响较大。通过western blotting检测F蛋白的裂解情况,发现F蛋白的裂解程度没有差异,说明HN突变体蛋白对F蛋白裂解的刺激程度没有差异。同时检测单独转染HN突变体质粒24 h后的HAd和NA活性,发现两株NDV HN蛋白的HAd和NA活性差异显著;5个突变对HAd活性具有不同程度的影响;F110L、G116R、A469V与T522I显著影响NA活性,G54S没有影响。以上结果表明,5个突变对HN蛋白的功能活性都有特定的影响,这两株NDV膜融合活性的差异可能正是与这些功能活性的变化有关,而与HN蛋白对F蛋白裂解的刺激无关。综上所述,我们发现HN蛋白对NDV的膜融合活性确实具有重要的影响,HN蛋白上5个突变可能使受体结合、神经氨酸酶与促膜融合活性在蛋白和病毒水平上达到了一种平衡状态,最终引起了两株NDV膜融合活性的差异。而L110、R116、V469与I522均为影响HN蛋白相应功能活性的关键氨基酸,这些都为后期NDV的致病性研究和减毒疫苗的研发提供了新的思路。