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目的:本研究课题在大鼠泻剂结肠模型建立后,进行恢复性饲养,通过观察大鼠回肠和横结肠5-HT免疫反应阳性的肠嗜铬细胞密度变化以及VIP免疫反应性变化,探讨肠嗜铬细胞、VIP神经元在停用泻剂后的恢复情况,了解肠神经系统损伤后的可逆转性,为临床工作提供理论依据。
方法:
1.动物分组:选取健康Wistar大鼠120只,雌雄各半,按照完全随机的方法进行分组,实验组80只,随机分为便秘组一与便秘组二各40只,对照组40只,分组后各组间体重、性别无显著性差异。
2.动物处理:便秘组一与便秘组二采用大黄浸液灌胃,首日剂量为800mg/kg(生粉),此后每日剂量在前一日基础上增加200mg/kg(生粉),直至实验组出现半数大鼠粪便变稀,保持剂量至80%的稀便消失,继续加量给药,至又有半数大鼠粪便变稀,如此程序循环3次,待实验组第三次80%的稀便消失一周后停止建模,便秘组一继续以维持量大黄灌胃,便秘组二以同等体积蒸馏水灌胃恢复饲养,时间为1个月。对照组从实验开始以同等体积蒸馏水灌胃饲养。
3.取材及标本处理:恢复性饲养1个月后选取便秘组一、便秘组二、对照组大鼠各20只,分别切取距回盲瓣5cm处回肠及横结肠标本,进行HE染色、肠嗜铬细胞、VIP免疫组化染色,光镜下观察结肠壁的变化,肠嗜铬细胞数量及形态变化,对VIP免疫组织化学染色行半定量分析及图像分析。
4.统计分析:数据采用SAS软件进行统计学处理分析,对所测定结果进行正态性及方差齐性检验,组间比较采用单因素方差分析检验,有差别者用q检验进一步两两比较,结肠肌间神经丛VIP阳性神经元免疫组织化学染色半定量结果,选用多个样本比较的秩和检验(Kruskal-wallis法)及多个样本两两比较的秩和检验(Nemenyi法),检验水准α=0.05。
结果:
1.肠道大体病理变化及HE染色:三组大鼠肠道外观无明显差别,结肠粘膜无色素沉着。对照组大鼠肠道切片HE染色未发现病变,便秘组一大鼠肠道切片HE染色可见明显粘膜慢性炎症改变。便秘组二可见粘膜慢性炎症改变,较便秘组一减轻。
2.肠嗜铬细胞染色:便秘组一、便秘组二及对照组大鼠肠道所有切片的粘膜层中均可见5-HT免疫反应阳性的肠嗜铬细胞,胞质和胞突中有棕色或棕黑色颗粒,核呈蓝色,背景呈淡黄色,对比鲜明,5-HT免疫反应阳性的肠嗜铬细胞形态多样,如锥形、梭形、圆形、椭圆形、杆形等。便秘组一大鼠肠道5-HT免疫反应阳性的肠嗜铬细胞密度高于对照组。便秘组二大鼠肠道5-HT免疫反应阳性的肠嗜铬细胞密度低于便秘组一但高于对照组。
3.VIP染色:光镜下观察发现,正常大鼠结肠肌问神经丛内VIP神经纤维呈“网状”分布,其神经节粗大,阳性神经元密集分布,胞体较大,节间束较粗,束内神经纤维分布密集,可见散在分布的阳性神经元。与对照组大鼠相比,便秘组大鼠结肠肌间神经丛VIP阳性神经节及节间束细小,节内神经元数量明显减少,节间束内神经纤维分布稀疏,阳性神经元胞体少见。图像分析显示,便秘组一大鼠结肠肌间神经丛内VIP阳性神经元面密度明显低于对照组大鼠。便秘组二大鼠肠肌间神经丛内VIP阳性神经元面密度面密度高于便秘组一但低于对照组。
结论:
1.长期应用大黄,大鼠肠嗜铬细胞对大黄刺激逐渐耐受,5-HT释放减少,导致泻剂结肠的产生,停用大黄后肠嗜铬细胞耐受性及5-HT的释放功能出现恢复。
2.泻剂结肠大鼠存在肠壁内VIP神经病理改变和功能障碍,停用大黄后大鼠肠肌间神经丛病理变化出现好转,肌间神经丛VIP免疫反应性较停药前增强,功能出现恢复。