论文部分内容阅读
目的:Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是一类病原分子识别受体,其生物学功能主要是识别微生物感染,促进炎症细胞因子的合成与释放,介导炎症反应和先天性免疫;TLRs活化后还可以促进免疫细胞表达免疫分子,促进抗原提呈细胞的成熟,从而诱导机体的获得性免疫反应,因而TLRs又是机体介导天然免疫转向获得性免疫的桥梁。TLR3是机体识别病毒双链RNA(dsRNA)的受体,在体内抗病毒感染中发挥重要作用。一方面dsRNA作用于TLR3诱导免疫细胞的活化,促使免疫细胞产生抗病毒细胞因子如IFNα、β等,发挥抗病毒天然免疫作用;另一方面活化的TLR3可介导组织细胞(如血管内皮细胞)的损伤,从而破坏宿主的血管屏障如血脑屏障,促进病毒的扩散。本研究的目的是在前期研究的基础上进一步分析活化TLR3诱导人静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的分子机制,寻找TLR3诱导细胞凋亡信号转导途径中的关键调控分子,并尝试以此为靶点对TLR3诱导的细胞凋亡进行干预,为临床选择新的靶点控制病毒性疾病的发展提供理论依据。方法:(1)RT-PCR检测基因的表达;(2)ELISA检测分泌蛋白的水平;(3)PI-Annexin V染色流式细胞术检测细胞凋亡水平;(4)抗体中和实验验证细胞因子与细胞凋亡的相关性;(5)Western-Blotting检测细胞信号转导分子的表达和活化情况;(6)SiRNA干扰技术下调目的基因的表达。结果:ELISA结果表明dsRNA的类似物Poly(I:C)作用于HUVEC细胞,上调TNF-α的分泌,且呈剂量依赖性;重组的TNF-α诱导了HUVEC细胞中NF-κB的活化,但不能诱导HUVEC细胞的凋亡,而且TNF-α的中和抗体不能下调Poly(I:C)诱导的细胞凋亡,说明Poly(I:C)活化TLR3诱导的细胞凋亡与TNF-α无关。Poly(I:C)作用于HUVEC细胞后,RT-PCR检测发现TRAIL、DR4和DR5的表达上调,且呈剂量依赖性;PI-Annexin V染色证明TRAIL中和抗体部分下调了Poly(I:C)诱导的细胞凋亡,表明TRAIL-DR4/5启动外源性凋亡途径参与了TLR3诱导的细胞凋亡。进一步的研究表明Poly(I:C)下调Bcl-2家族中促生存蛋白Bcl-2的表达,上调Bcl-2家族中促凋亡蛋白Noxa和Puma的表达,同时上调细胞周期调控分子P21的表达,由于这些分子同时受肿瘤抑制基因P53或其家族成员的调控,提示P53或其家族成员参与了TLR3诱导的通过内源性途径介导的细胞损伤。然而RT-PCR结果显示活化TLR3并不引起P53的表达改变,P53的抑制剂也不影响Poly(I:C)诱导的细胞凋亡,表明P53没有参与Poly(I:C)诱导的损伤;当检测P53家族成员P63的表达时发现,Poly(I:C)上调TAP63α的表达;而且SiRNA抑制TAP63α蛋白的表达后,抑制了Bcl-2的下调,抑制了Noxa的上调,抑制了Caspase8、Caspase 9和PARP的活化,并显著抑制Poly(I:C)诱导的细胞凋亡,表明TAP63α是调控TLR3诱导细胞损伤的关键分子。结论:TNF-α不参与TLR3诱导的HUVEC细胞凋亡的外源性途径的启动;TRAIL-DR4/DR5作用机制参与了TLR3诱导的HUVEC细胞凋亡的细胞外途径的启动;TLR3通过下调Bcl-2家族中的促生存分子Bcl-2表达,上调促凋亡分子Noxa表达上调启动内源性细胞凋亡。P53家族成员TAp63α是TLR3诱导的HUVEC细胞凋亡的关键调控分子。