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奎尼酸(QA)是一种具有极高价值的精细化工产品和医药中间体，在医药工业、食品工业、化工等行业均有广泛的用途，市场需求很大。 大肠杆菌中存在着芳香族代谢途径(莽草酸途径)，该途径中间代谢产物3-脱氢奎尼酸(3-DHQ)是奎尼酸前体化合物，进一步氧化便可生成奎尼酸。我们将代谢工程技术应用于产奎尼酸基因工程菌的构建。利用大肠杆菌莽草酸途径合成新的代谢物奎尼酸。依据代谢工程原理，通过增加途径关键酶基因的拷贝数来提高酶含量以及解除关键酶所受到的反馈抑制保持酶活性，调整微生物的代谢流分布，将碳代谢流最大程度的引向奎尼酸生成的方向。 aroF基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHP Synthetase，DS)是第一个关键酶。它催化芳香族生物合成共同途径上的前体物E4P和PEP缩合生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)，该酶受菌体内代谢产物的反馈抑制。 根据大肠杆菌中aroF基因序列和Lisa等研究报道，设计了两组扩增引物，利用PCR技术对aroF基因第148个氨基酸定点突变扩增抗反馈抑制aroF~m基因，将其克隆入高效原核表达载体pBV220载体中。重组子经温度诱导表达，SDS-PAGE图谱显示39KD处新增蛋白带与预期的分子量一致，并实现了高表达。以空宿主菌的粗提物酶活性比为1.0，携带pBV220-aroF~m质粒的宿主菌，其aroF~m酶活性提高了9.6倍 aroB基因编码的脱氢奎尼酸合成酶是莽草酸代谢途径中的第二步关键酶，催化DAHP形成3-DHQ。我们根据大肠杆菌中aroB基因的序列设计了一对引物，利用PCR技术扩增得到aroB基因，将其克隆入高效原核表达载体pBV220载体中。重组子经温度诱导表达，SDS-PAGE图谱显示了新增40KD蛋白带，实现了脱氢奎尼酸合成酶基因在大肠杆菌中的高效表达。 此外我们根据Draths等在莽草酸生物合成研究中发现aroE编码的莽草酸脱氢酶能够将DHQ转化为QA，且体外实验证明其具有奎尼酸脱氢酶活性。从大肠杆菌中利用PCR技术扩增aroE基因，将其构建到表达载体pBV220上进行表达并实现了高表达。SDS-PAGE显示：重组菌热诱导后表达出大小约30KD的蛋白，表达