家蚕性别决定既是基本的生物学问题,也与蚕丝产业密切相关,长期以来受到人们的高度关注。家蚕为雌杂合型,经典遗传学研究表明在W染色体上的一个强雌性决定因子（Fem）决定个体为雌性,但是到目前为止Fem还没有被鉴定出来。2001年Ohbayashi等克隆了果蝇性别决定级联末端基因dsx在家蚕中的同源体Bmdsx,发现其与果蝇dsx相似:Bmdsx的初级转录物在雌性和雄性中也是通过选择性拼接产生性别特异性成熟mRNA来控制家蚕性别的末端分化。但是Bmdsx基因前体mRNA选择性拼接的调控机制与果蝇dsx不同,果蝇中默认的拼接方式为雄特异性的,在雌性中TRA/TRA-2激活了雌特异性拼接,而家蚕中Bmdsx默认的拼接方式为雌特异性的,在雄性中由于受到某一阻遏机制的作用使得Bmdsx前体mRNA的第3和第4外显子的拼接受到抑制。遗憾的是,到目前为止对于从上游的Fem到下游Bmdsx之间的性别调控途径仍然不清楚。为了弄清家蚕Bmdsx之上的性别调控途径,本文首先利用基因芯片分析了早期胚胎雌雄差异表达基因,其次通过蛋白与RNA结合及质谱对调控Bmdsx拼接的因子进行了鉴定,并对可能的Fem候选基因进行了克隆及转基因研究。获得的主要结果如下:1.基于基因芯片的家蚕早期胚胎雌雄差异表达基因分析家蚕的性别决定于胚胎发育的早期,理论上,参与家蚕性别决定的基因在胚胎发育的早期应该有雌雄表达上的差异。为了寻找参与家蚕性别决定的基因,我们利用基因芯片来寻找在早期胚胎有雌雄表达差异的基因。以胚胎期根据卵色就能分开雌雄的限性白卵品种为材料,取受精后48小时、60小时、72小时、96小时4个时间点的雌雄胚胎,以受精后4小时胚胎为对照进行芯片杂交。其结果,共筛选出4049个至少在一个时间点有雌雄表达差异的基因。GO分类表明,这些基因的功能主要为催化功能,核酸结合,蛋白结合以及转录调控功能,参与代谢过程,发育过程,生物过程的调控以及色素形成。其中有2432个差异表达基因是由于受精后合子基因在雌雄中的转录差异而造成的。1062个基因是由于母体转录物在雌雄中降解程度的不同而导致的差异。以受精后4小时为参照,分析发现,在受精后48小时、60小时、72小时和96小时,每一个时间点相对于受精后4小时上调表达的基因总比下调表达的基因数目多,这说明早期胚胎雌雄之间的差异更多的是由于合子基因在雌雄中转录水平的差异而造成的。将这些相对于受精后4小时上调表达的雌雄差异表达基因进行聚类,发现这些基因在雌雄中的表达模式不同,在雌性中的48小时形成一个峰,表达量从48小时到72小时逐渐下降,到96小时又上升;而在雄性中绝大多数基因是从48小时到72小时逐渐上升,到96小时又下降。这可能与胚胎发育的早期雌雄蚕卵的着色不同有关。综合分析结果,找到了81个在一个以上的时间点有雌雄表达差异的选择性剪接体,占所有选择性剪接体的21.8%,这些剪接体属于43个基因。它们主要为具有催化活性的各种酶类和具有结合蛋白或核酸功能的蛋白。此外,分析还发现了17个具有雌雄表达差异的前体mRNA拼接因子。其中有4个hnRNP蛋白,4个snRNP蛋白,以及其它的RNA结合蛋白。2.Bmsxl及Bmrbp1的功能研究sxl是果蝇性别决定调控级联中的一个关键基因,以前的研究者克隆了Bmsxl的两种拼接形式Bmsxl-PA和Bmsxl-PB,发现Bmsxl-PB在精巢特异表达。在果蝇中,SXL通过结合到拼接位点附近的一串富含尿嘧啶的poly（U）序列上阻遏该位点的拼接,从而调控下游基因tra的性别特异性拼接,而在家蚕Bmdsx的第3内含子的3′拼接位点处刚好有一串富含尿嘧啶的poly（U）序列,那么BmSXL-PB是否结合到这一段序列上阻遏了Bmdsx第3和第4外显子在雄性中的拼接?BmSXL-PB是不是Bmdsx上游的关键性调控因子?为了弄清这两个问题,本研究通过poly（U）序列与雌性和雄性核抽提物的gel-shift实验,结果表明,BmSXL-PB并没有结合到Bmdsx的第3内含子的3′拼接位点处的poly（U）序列上。同时以限性白卵品种为材料,通过RT-PCR检测表明Bmsxl-PB在雌雄胚胎中表达量及其微弱,并且没有雌雄表达差异。这些结果说明BmSXL-PB并不是调控Bmdsx前体mRNA雄特异性拼接的的关键性拼接阻遏因子。RBP1是参与果蝇性别决定基因dsx前体mRNA选择性拼接的重要拼接因子。本研究克隆了rbp1在家蚕中的同源体Bmrbp1基因。发现Bmrbp1前体mRNA通过选择性拼接产生四种成熟mRNA,分别命名为Bmrbp1-PA,Bmrbp1-PB,Bmrbp1-PC和Bmrbp1-PD,分别编码142 aa,159 aa,91 aa和117 aa。其中BmRBP1-PA和BmRBP1-PD具有一个N末端RRM结构域和一个C末端RS结构域,而BmRBP1-PB和BmRBP1-PC只具有一个N末端RRM结构域。氨基酸序列比对表明BmRBP1-PA与在其它昆虫中的同源体保守性很高,并与其它SR家族蛋白在RRM结构域高度保守。RT-PCR结果表明Bmrbpl-PA在所检测的不同组织和各个发育时期均有高量表达,Bmrbp1-PB在所检测的这些组织和时期表达很弱,并且Bmrbp1-PA和Bmrbp1-PB在雌雄中无明显的表达差异,而Bmrbp1-PC和Bmrbp1-PD则很难检测到。这些结果表明BmRBP1应该是一个SR类拼接因子,但是否参与家蚕Bmdsx前体mRNA的性别特异性拼接还需要进一步研究。3.Bmdsx上游的拼接调控因子BmHrp28的鉴定Suzuki等的研究表明Bmdsx第4外显子对Bmdsx前体mRNA的雄特异性拼接起着决定性的作用,并且在该外显子上存在3个关键性的顺式调控元件,发现BmPSI能够结合到顺式调控元件CE1上调控Bmdsx的拼接。为了寻找其它调控Bmdsx雄特异性拼接的因子,我们在Bmdsx第4外显子上共设计了5个RNA探针做UV cross-linking及gel-shift实验,发现有核蛋白结合在探针CE1+6上,UV cross-linking实验表明结合的蛋白大约为28 kD,将结合的蛋白带从胶上切下,通过LC-MS/MS对结合的蛋白进行鉴定,根据质谱鉴定的结果克隆出该基因完整的编码区,结果表明该基因编码256 aa,为果蝇核糖核蛋白Hrp48在家蚕中的同源体,命名为BmHrp28,大小为28.2 kD,在N端含有两个RRM结构域,C端含有一个甘氨酸富集结构域。氨基酸序列比对表明BmHrp28与哺乳动物中的hnRNP A1以及果蝇Hrp48在RRM结构域高度保守。将BmHrp28基因编码区用pET50b载体进行原核表达并进行纯化,gel-shift和UV cross-linking实验表明纯化的BmHrp28蛋白能够特异地结合到探针CE1+6上。这些结果表明BmHrp28能特异结合到Bmdsx的第4外显子上,应该是一个参与家蚕Bmdsx前体mRNA雄特异性拼接的拼接因子。4.Fem侯选基因BmWZF1,BmWZF2的分子克隆及功能研究Mita等在2006年的第七次鳞翅目昆虫分子生物学和遗传学国际研讨会上提到它们发现了位于家蚕W染色体上的两个锌指蛋白基因,并且它们在第25连锁群上有序列相似的同源拷贝。根据这一信息,我们通过对25连锁群上所有预测的锌指蛋白基因、家蚕EST以及基因组序列的分析,找到了一条与基因组序列有很明显的差异的EST,由于家蚕基因组测序并没有测W染色体序列,因此,该EST可能来自W染色体。根据该EST克隆了两种来自W染色体的mRNA分子,分别命名为BmWZF1-PA和BmWZF1-PB,两者仅仅相差56 nt,并且都包含完整的ORF,分别编码360 aa和386 aa,推测这两种mRNA分子可能由同一个基因通过选择性拼接产生。结构域预测表明它们均含有1个脯氨酸结构域和2个CCCH结构域。通常脯氨酸结构域参与蛋白质与蛋白质之间的相互作用,CCCH结构域具有结合DNA或RNA的作用,参与mRNA的拼接调控。将BmWZF1蛋白在NCBI进行同源性检索表明BmWZF1与小鼠CHCR基因、果蝇muscileblind基因具有一定的相似性。果蝇Muscleblind蛋白通过调控下游基因的选择性拼接来调控肌肉的末端分化。这意味着BmWZF1可能为一个拼接因子,调控下游基因的选择性拼接。随后以BmWZF1为起点,向BmWZF1基因的3′端延伸,克隆了位于W染色体上BmWZF1的3′端的另外一个锌指蛋白基因BmWZF2。发现该基因编码363 aa,含有6个C₂H₂结构域。通常C₂H₂结构域具有结合DNA的功能,将BmWZF2蛋白在NCBI进行同源性检索发现与其他物种的转录因子相似性很高。推测该基因编码的蛋白为一个转录因子,可能对下游靶基因起到转录调控的作用。将BmWZF1和BmWZF2的核苷酸序列与家蚕基因组序列进行BLASTN比对,发现两个基因在常染色体均有两个序列高度一致的拷贝,其中BmWZF1在常染色体上的两个拷贝命名为BmAZF1a和BmAZF1b。BmWZF2在常染色体上的两个拷贝命名为BmAZF2a和BmAZF2b。发现BmAZF1a,BmAZF1b,BmAZF2a和BmAZF2b都位于家蚕第25连锁群,并且依次排列成一串,其中BmAZF1a和BmAZF2a的转录方向相对。根据家蚕基因组序列,预测的CDS及EST信息分别对常染色体上的锌指蛋白基因BmAZF1a,BmAZF1b,BmAZF2a,BmAZF2b进行克隆。发现BmAZF1a存在选择性拼接,主要为两种mRNA形式,分别编码360 aa和386 aa的蛋白。均含有1个脯氨酸结构域和2个CCCH结构域。并且发现BmAZF1a基因存在多个单核营酸多态性（SNP）位点,由于SNP的存在导致BmAZF1a基因编码几种不同的蛋白。将BmWZF1和BmAZF1a编码的氨基酸序列进行比对发现两者能够编码氨基酸序列完全一致的蛋白,只是由于BmAZF1a存在多个SNP位点导致编码多种其它形式的蛋白。这说明BmWZF1和BmAZF1a可能在家蚕中行使着同样的功能。BmAZF1b基因编码456 aa,同样含有1个脯氨酸结构域和2个CCCH结构域,由11个外显子和10内含子组成。核苷酸和氨基酸序列比对表明BmAZF1b与BmWZF1,BmAZF1a在核苷酸和蛋白序列上均存在较大的差异。说明BmAZF1b可能由于序列变异变成了与BmWZF1和BmAZF1a功能完全不同的另外一个基因。BmAZF2a基因前体mRNA通过选择性拼接产生两种成熟mRNA分子,BmAZF2a-PA和BmAZF2a-PB,分别编码590 aa和157 aa。结构域预测表明BmAZF2a-PA含有12个C₂H₂结构域,BmAZF2a-PB含有6个C₂H₂结构域。BmAZF2a-PA由12个外显子和11内含子组成。BmAZF2b基因编码599 aa,含有11个C₂H₂结构域,由11个外显子和10个内含子组成。将BmAZF2a和BmAZF2b蛋白在NCBI进行BLAST检索表明均与其它物种中的转录因子高度保守,说明这两个基因编码的蛋白也为转录因子,可能调控下游基因的转录。将BmAZF2a和BmAZF2b的氨基酸序列进行比对表明两者氨基酸序列高度相似。氨基酸序列比对表明BmWZF2与BmAZF2a、BmAZF2b相似性很高,但在N端比BmAZF2a、BmAZF2b少一段序列。以限性白卵为材料,通过RT-PCR检测各个基因在胚胎期的表达情况。结果表明BmWZF1是在受精后大约36小时才开始进行表达,并且仅仅在雌性胚胎中表达,由于家蚕的性别是在胚胎发育的早期就决定了的,作为初始信号的Fem基因应该是在受精后胚胎发育的某一时间点才开始在雌性中进行表达。这说明,BmWZF1基因很有可能就是经典遗传学推测的位于W染色体上的Fem基因。RT-PCR结果显示BmAZF1a,BmAZF1b,BmAZF2a和BmAZF2b在未受精卵及整个胚胎发育过程中均有高量表达,并且在雌雄中无表达差异。对BmWZF1基因进行RNAi之后发现一些雌蛾卵巢管内的卵排列出现混乱,同时粘腺也出现异常,正常雌蛾的两个粘腺应该一样大小,而异常个体的两个粘腺其中一个大另一个小。随后进一步通过转基因来验证BmWZF1基因是否起性别决定的作用,结果发现将BmWZF1基因转到雄性和雌性后对性别并没产生什么影响,而RT-PCR结果表明外源BmWZF1基因在mRNA水平的转录量很高。这些结果说明将BmWZF1进行转基因后并没有改变个体的性别,可能只转BmWZF1一个基因并不能对雌雄性别产生影响。5.家蚕性别决定调控途径的推测经典遗传学的研究表明家蚕的性别由位于W染色体上一个推测的Fem基因决定,但Fem基因的具体分子形式一直没鉴定出来。Suzuki等的研究表明Bmdsx为位于家蚕性别决定途径末端的基因,而在Bmdsx之上家蚕的性别调控途径与果蝇似乎不同,同时发现BmPSI为调控Bmdsx前体mRNA雄特异性拼接的一个拼接因子。而BmPSI在果蝇中的同源体PSI为调控P元件转座酶组织特异性拼接的关键基因,因此,BmPSI也有可能是调控Bmdsx拼接的关键基因。在本研究中,我们发现了调控Bmdsx前体mRNA拼接的另外一个拼接因子BmHrp28,它能特异地结合到Bmdsx第4外显子的顺式调控元件CE1+6上。我们还克隆了两个来自W染色体的锌指蛋白基因BmWZF1和BmWZF2,它们可能为经典遗传学所预测的Fem基因。根据目前的这些研究结果,我们推测家蚕性别决定的主干途径如下图所示: