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实验背景肿瘤严重威胁人们的生命健康,肿瘤之所以治愈率差的关键原因在于其转移程度,分化程度和不可根治性,因此对于肿瘤转移机制的研究尤为重要。L-选择蛋白为Ⅰ型跨膜糖蛋白,其N-末端的C型凝集素样结构域,又称糖识别域,可以结合糖配体。Fucoidan是L-选择蛋白的天然糖配体,具有硫酸化结构,可以与L-选择蛋白结合,促进细胞的迁移和黏附能力。此外,L-选择蛋白在淋巴细胞归巢,白细胞在内皮细胞的滚动,黏附中发挥重要的生物学作用。新近研究发现,L-选择蛋白与甘露糖受体(mannose receptor,MR)结合可能介导肿瘤细胞的淋巴道转移,而且恶性淋巴瘤P388D1细胞的淋巴道转移依赖于L-选择蛋白的表达。趋化因子是一类小分子促炎因子,小分子蛋白多肽,可由多种细胞产生。CXCR4是趋化因子CXCL12(SDF-1)的特异性受体,它不仅表达于细胞表面,也可在胞浆中检测到。CXCR4在中枢神经系统、免疫系统和将近30余种肿瘤细胞广泛表达。而且CXCR4/SDF-1相互作用能够调控HacF、HacP细胞分泌基质金属蛋白酶的能力,从而影响它们转移潜能。已有研究发现,在正常人血液中T淋巴细胞上存在L-选择蛋白和CXCR4的表达,当L-选择蛋白与其天然配体结合后会引起下游信号传导,导致细胞内的CXCR4瞬间聚集到细胞表面,这种现象可导致细胞迁移能力和淋巴结黏附能力增强。P388D1细胞是小鼠恶性淋巴瘤细胞,属于淋巴系统的肿瘤细胞,其表面也存在L-选择蛋白和趋化因子受体CXCR4的表达。并且已有研究证明在淋巴结内皮上有L-选择蛋白配体的表达,那么当与L-选择蛋白结合以后,是否会使小鼠恶性淋巴瘤P388D1细胞膜上的CXCR4表达上调,促进肿瘤细胞通过高内皮静脉(HEVs)从血管进入淋巴结,进而影响肿瘤的淋巴道转移。实验目的本文以恶性淋巴瘤P388D1细胞为研究对象,使用L-选择蛋白的天然配体Fucoidan刺激P388D1细胞后,观察L-选择蛋白与趋化因子受体CXCR4之间的相互作用关系及功能变化,进而探讨其与肿瘤淋巴道转移的分子机制。实验方法1)使用不同浓度的L-选择蛋白的天然配体(Fucoidan)作用于P388D1细胞,经SDF-1诱导,通过钙离子内流实验,检测具有功能性CXCR4的表达量的变化,：Hca-F细胞对照；使用具有硫酸化结构的肝素作用P388D1细胞,检测具有功能性CXCR4的表达量的变化(方法同上),Fucoidan、壳寡糖对照；使用L-选择蛋白表达缺失的Hca-F细胞,瞬时转染L-选择蛋白后,在用Fucoidan作用于该细胞,检测具有功能性CXCR4的表达量的变化2)使用Fucoidan作用P388D 1细胞后,SDF-1诱导,明胶酶谱检测基质金属蛋白酶MMP2和MMP9分泌。实验结果1)趋化因子受体CXCR4和L-选择蛋白在P388D1细胞上均有表达,对照Hca-F细胞中CXCR4有表达,L-选择蛋白表达缺失。2)当用L-选择蛋白的天然配体Fucoidan作用P388D1细胞后,细胞膜上具有功能性的CXCR4的表达量升高,并且具有剂量依赖性,而对照Hca-F细胞未发现变化；当用具有硫酸化结构的肝素和Fucoidan作用P388D1细胞,发现细胞膜上具有功能性的CXCR4的表达量升高,对照壳寡糖没有变化；当用L-选择蛋白质粒瞬时转染HcaF细胞后,在用L-选择蛋白的天然配体Fucoidan作用于该细胞,发现转染后的细胞胞膜上具有功能性的CXCR4的表达量升高。3)明胶酶谱显示的实验结果表明,在L-选择蛋白的天然配体Fucoidan作用P388D 1细胞后,经SDF-1诱导,基质金属蛋白酶MMP2分泌增强,MMP9未检测到。结论在小鼠恶性淋巴瘤P388D1细胞中,L-选择蛋白可能与硫酸化的糖结合,导致细胞内CXCR4瞬间聚集到细胞表面,继而介导淋巴道转移。