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合浦珠母贝(Pinctada fucata)是一种重要的海水养殖生产珍珠的母贝,复杂的的海洋生存环境及插入异物的特殊养殖过程等内外因素都会使合浦珠母贝受到刺激,从而产生大量具有抗菌活性的物质以增强免疫力。通过长期的进化合浦珠母贝形成了特殊的体内免疫机制,內源性抗菌物质丰富。研究表明,共附生的海洋微生物能产生与其宿主相同或相似的生理活性成分,这些活性物质具有很大的开发潜力。因此本文选取海南及深圳基地采集的合浦珠母贝,以其黏液作为原料分离筛选抗菌肽产生菌,以期进一步开发为天然食品防腐剂。本研究的主要内容如下: 从海南及深圳水产养殖基地采集不同生长阶段的合浦珠母贝,以其黏液作为分离材料,稀释涂布于六种不同的分离培养基,对合浦珠母贝样品中共附生微生物进行分离纯化。将纯化后的菌株在适当条件下发酵并收集取上清液,利用牛津杯扩散法对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)这八种指示菌进行抑菌实验,筛选抑菌活性物质产生菌。 对筛选出对抑菌能力强、抑菌谱广的菌株发酵液抗菌物质进行酸类抑制作用的排除、过氧化氢抑制作用的排除以及蛋白酶敏感性来筛选抗菌蛋白或多肽产生菌株。对通过筛选的抗菌肽产生菌株进行菌株形态、生理生化及16S rDNA序列分析鉴定。研究温度、pH及传代次数等因素对该菌株的影响。 对选定菌株的的发酵液进行粗提取,并研究其粗提取物的分子量范围、抑菌谱、热稳定性、pH稳定性等因素对其抑菌活性的影响。将粗提物应用于罗非鱼片的防腐保鲜,通过考察冷藏过程中细菌总数、理化指标以及感官评定对其抑菌效果进行评价。 实验结果表明以3种不同地点采集的合浦珠母贝黏液为样品,共分离得到127株菌株,其中具有抗菌活性物质产生菌共31株,总体来看插核后的样品中代谢产生抗菌活性物质共附生菌比例高于插核前的样品。从这31株抗菌活性物质产生菌中筛选出的17株具有抑菌能力强、抑菌谱广的菌株,经过排除酸及过氧化氢的干扰作用实验,以及四种蛋白酶酶解处理后,发现菌株SZAI09、SZAI17和SZAI35的发酵液中含有蛋白或多肽类抑菌成分,特别是菌株SZAI09抗菌活性在酶解前后变化明显。而且菌株SZAI09抗菌谱广,抑菌能力强,最终确定菌株SZAI09为优良抗菌肽产生菌进行进一步研究。 根据菌株SZAI09菌落特征及生理生化结果初步鉴定为乳杆菌,其16S rDNA序列与GenBank数据库中已知序列中模式菌株Lactobacillus coryniformis subsp. torquens KCTC3535T序列相似性高达100％,确定菌株 SZAI09为棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)。菌株 SZAI09生物学特性研究表明菌株SZAI09具有的良好的遗传稳定性;最适生长温度为30℃;最适pH为7.0;通过该菌株的生长曲线发现该菌的生长速度较快,在接种后培养24h左右时菌量最多。 当硫酸铵饱和度为60%时,菌株 SZAI09发酵液析出的抗菌肽最多;该抗菌肽分子量主要集中在5000-10000Da范围内,且对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌都有抑菌作用,抑菌谱广,其中对金黄色葡萄球菌抑菌作用最强。菌株SZAI09抗菌肽具有相当好的热稳定性,在100℃处理30min活性降低缓慢,活性仅下降了32%左右;pH对抗菌活性物质较为敏感,其中pH为6.0左右时活性影响不大。罗非鱼片的防腐保鲜实验表明棒状乳杆菌 SZAI09抗菌肽对罗非鱼片具有明显的保鲜作用,可使罗非鱼肉冷藏保质期延长4天以上,与同浓度Nisin相比,棒状乳杆菌SZAI09抗菌肽保鲜效果相当,具有继续开发研究的潜力。