基于编码磁性微粒的病原微生物快速高通量检测技术研究

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为了适应临床病原微生物检测需求,保障国家公共卫生安全,提高人民健康水平,建立能对病原微生物特征信息进行快速、多靶点检测且适用于自动化平台的分子诊断新技术十分必要,具有非常重要的实用价值和社会意义。致泻性大肠埃希氏菌在腹泻菌中占有很大比例,主要是通过污染的食物和水传播,我国检出率较高的地区主要在山东、福建、河南。传统的检测方法主要是以培养为基础的形态学检测和生化检测,这种方法操作繁琐、检测时间长,难以满足临床检测要求。随着分子生物学的发展,以核酸为基础的检测方法越来越多的应用到病原微生物的检测,但大多方法普遍难以实现高通量自动化检测。本研究旨在结合多重PCR和编码磁性微粒的优势,以大肠埃希氏菌(E.coli)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasive E.colic,EIEC)、肠致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenic E.colic,EPEC)、肠产毒性大肠埃希氏菌(enterotoxigenic E.coli,ETEC)、出血性大肠埃希氏菌(enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)为检测靶标,建立了一种新型、快速、高通量且易于实现自动化检测的方法,从而能够快速、准确、高效地检测病原微生物。本研究的主要内容包括以下几个方面:第一,多重PCR反应体系的构建。以肠侵袭性大肠埃希氏菌、肠致病性大肠埃希氏菌、肠产毒性大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌为检测目标设计了8对特异性引物和一对通用引物。对多重PCR中第一步PCR中的第一阶段,即基因特异性引物扩增阶段的循环数进行了优化,确定12循环效果更好。调试了特异性扩增阶段混合引物中各引物的工作浓度,最后确定uid A、ipaH、stx2、stx1、eae、rfbe、ST、LT的最佳工作浓度分别为0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.4μM、0.4μM、0.4μM、0.8μM。第二,多重PCR结合基因芯片检测方法的研究。针对4种致泻性大肠埃希氏菌的靶基因设计了对应的捕获探针序列、对照探针序列以及阳性对照组的互补序列。通过多重PCR和基因芯片技术联用,建立了基因芯片检测方法。确定了EHEC、ETEC、EPEC、EIEC、E.coli的检测灵敏度分别为1.3×104 CFU/mL、2×105 CFU/mL、4×104 CFU/mL、7.2×104 CFU/mL、1.7 CFU/mL。第三,用构建的多重PCR结合编码磁性微粒芯片的检测方法研究。应用编码磁性微粒芯片检测5种大肠埃希氏菌,检测特异性好,EHEC、ETEC、EPEC、EIEC、E.coli的检测灵敏度可达1.3×104 CFU/mL、2×104 CFU/mL、4×104 CFU/mL、7.2×104 CFU/mL、1.7 CFU/mL。编码磁性微粒芯片的单个菌株检测结果与基因芯片结果相近,但对于菌株中的单个靶分子,大多数编码磁性微粒芯片的检测灵敏度更高。
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