【摘 要】
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为了研究ELDF10基因在DS19细胞中的功能。首先,将ELDF10的编码区克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,表达融合蛋白。利用Lipofectin法转染到MEL-DS19中,使DS19细胞过表达ELDF10蛋
【出 处】
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中国协和医科大学 中国医学科学院 北京协和医学院 清华大学医学部
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为了研究ELDF10基因在DS19细胞中的功能。首先,将ELDF10的编码区克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,表达融合蛋白。利用Lipofectin法转染到MEL-DS19中,使DS19细胞过表达ELDF10蛋白,观察是否对肿瘤细胞的增殖和分化有影响,初步探讨ELDF10基因在DSλ9细胞中的功能。
转染的重组真核表达载体和空载体,经G418筛选得到稳定表达抗性克隆。
用RT-PCR方法在mRNA水平检测转染重组质粒、转染空载体和正常肿瘤细胞中ELDF10基因的表达,以在组织中恒定表达的GAPDH为对照,结果转染重组质粒细胞中ELDF10mRNA表达量增加。
测定三种细胞的生长曲线,发现在这三种细胞中,转染空载体的细胞生长速度明显低于转染重组质粒和正常的肿瘤细胞,转染重组质粒的生长速度比正常DS19细胞略有增加,说明空载体在肿瘤细胞中表达GFP蛋白对细胞生长有明显的抑制作用,但与GFP融合表达的重组蛋白对肿瘤细胞有促进增殖作用。
流式细胞仪检测细胞周期发现,转染重组质粒的细胞较转染空载体和正常细胞G1期细胞减少,G2期细胞增多,表明ELDFi0-GFP融合蛋白可以减少细胞增殖周期时间,促进细胞增殖。
联苯胺染色阳性是细胞分化成熟的一个标志,对三种细胞进行联苯胺染色,观察有无血红蛋白在胞浆中表达,结果均为阴性。说明ELDF10-GFP融合蛋白可能没有诱导细胞分化作用。
RT-PCR在mRNA水平检测β珠蛋白的表达,以GAPDH为对照,结果转染重组质粒细胞中β珠蛋白的表达有所下降。
为了阐明ELDF10对DS19细胞促增殖的机制,用WesternBlot方法检测磷酸化ERK1/2激酶的水平,可见转染重组质粒细胞中磷酸化的ERK1/2增加,ELDF10蛋白可能是通过ERK途径促进细胞增殖并调节细胞特定基因的表达。
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