【摘 要】
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目的:基于酿酒酵母表面展示技术构建H.pylori口服疫苗,并对其免疫原性进行分析。方法:本论文以H.pylori基因组DNA(基因库编号:CP009259.1)为模板,PCR扩增UreB基因和VacA。将Nhe I/EcoR I双酶切后的UreB基因和VacA基因分别与pYD1(Nhe I/EcoR I)连接并转化至感受态E.coli DH5α,获得重组质粒pYD1-UreB和pYD1-VacA
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目的:基于酿酒酵母表面展示技术构建H.pylori口服疫苗,并对其免疫原性进行分析。方法:本论文以H.pylori基因组DNA（基因库编号:CP009259.1）为模板,PCR扩增UreB基因和VacA。将Nhe I/EcoR I双酶切后的UreB基因和VacA基因分别与pYD1（Nhe I/EcoR I）连接并转化至感受态E.coli DH5α,获得重组质粒pYD1-UreB和pYD1-VacA,进一步转化至感受态S.cerevisiae EBY100,通过色氨酸（Trp-）缺陷型培养基筛选获得EBY100/pYD1-UreB和EBY100/pYD1-VacA。与此同时,构建EBY100/pYD1,作为后续实验的阴性对照。通过Western blot、免疫荧光标记以及流式细胞仪检测UreB和VacA蛋白的特异性表达、定位以及展示效率。以SPF级BALB/c小鼠作为动物模型,EBY100/pYD1-UreB、EBY100/pYD1-VacA、EBY100/pYD1-UreB+EBY100/pYD1-VacA作为实验组,PBS和EBY100/pYD1作为对照组。口服免疫安排:1次/周,150 OD600nm/次,共六次。在初次免疫后第14天、28天和42天,收集小鼠血清及粪便。通过ELISA检测特异性IgG及分泌型IgA。在第56天,进行H.pylori SSl感染实验。感染安排:H.pylori SSl活菌（浓度为1×109CFU/m L）,每隔一天一次,0.5 m L/次,共4次。在第70天,处死小鼠,取小鼠胃部组织,通过H.pylori细菌培养方法和尿素酶试验,对小鼠胃中H.pylori的定植数量进行检测。结果:通过PCR和测序鉴定,成功地构建了表面展示型EBY100/pYD1-UreB和EBY100/pYD1-VacA。通过Western blot分析,UreB和VacA蛋白的分子量约为72 k Da和37.7 k Da。通过免疫荧光标记和流式细胞仪分析,UreB蛋白和VacA蛋白均表达于EBY100表面,展示效率分别为55.07%和31.90%。EBY100/pYD1-UreB、EBY100/pYD1-VacA、EBY100/pYD1-UreB+EBY100/pYD1-VacA口服免疫BALB/c小鼠均能诱导特异性血清IgG和分泌型IgA（<0.05）。H.pylori感染分析表明EBY100/pYD1-UreB组、EBY100/pYD1-VacA组、EBY100/pYD1-UreB+EBY100/pYD1-VacA组的细菌定植数量分别为105.58±0.09CFU/mg、105.61±0.08 CFU/mg、105.00±0.19 CFU/mg。结论:表面展示型酿酒酵母可以作为H.pylori口服疫苗的递送载体,这一技术平台的建立将为开发其它细菌或病毒口服疫苗提供新的研究策略。
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