背景与目的:T细胞在发育过程中,其抗原受体(T cell receptor,TCR)胚系基因中可变区(variable region,V)、多样区(diverse region,D)、连接区(jioning region,J)基因片段经历重组。具有淋巴细胞特异性的重组激活酶(recombinant-activating genes,RAGs)通过特异性识别位于V、D、J基因片段侧翼的重组信号序列(recombinationsignal sequences,RSS),催化DNA双链断开,在末端脱氧核糖核酸转移酶(terminaldeoxynucleotidy transferase,TdT)等非同源末端连接蛋白作用下,介导N个核苷酸的随机插入,将重组后V、D、J各一个片段的断端连接并修复。众多VDJC基因片段的不同组合可形成多种多样的TCR,产生无数种带有针对单一抗原表位的特异性抗原受体,赋予T细胞识别外来抗原的巨大潜力。　　 在RAGs作用下,TCRβ基因首先进行DJ基因片段重排,随后V-DJ重排,并形成功能性的β链表达于细胞表面,进一步与pre-TCR的替代轻链pTa组装成pre-TCR,依序诱导下列效应:暂时性下调RAGs的表达；T细胞进一步克隆扩增,并发育进入双阳性阶段；关闭TCRβ基因重排,以确保只有一个TCRβ等位基因重排,即等位基因排斥(allelic exclusion)；触发TCR a基因重排；最后,细胞表达成熟TCR aβ,pTa及RAGs的表达被关闭。　　 经典的免疫学理论认为,RAGs基因仅特异地表达于T细胞发育的早期阶段,当成熟的T细胞迁出胸腺后,不再表达RAGs基因和发生VDJ基因片段的重组,T细胞将表达特定的功能性抗原受体基因重排,其中具有自身抗原识别特异性的T细胞在释放到外周前将经历凋亡、克隆性删除。然而有学者研究认为,细胞表面的功能性TCR aβ并不能充分沉默RAGs的表达,成熟的T细胞能够再次开放表达RAGs,并介导VDJ片段的重新组合,进而改变其抗原识别的特异性,以一种全新的受体取代原有的受体,不仅避免被清除或凋亡,同时也提高了TCR库(Repertoire)的多样性。　　 TCR二次重排已成为国内外免疫学研究热点,经过多年的研究努力,已被普遍认为是中枢耐受形成的主流机制,不仅介导免疫系统中枢和外周免疫耐受、丰富T细胞受体库多样性,还与临床自身免疫病、肿瘤、感染等疾病的发生发展密切相关。但由于二次重排涉及的分子机制和研究体系均相当复杂,还没有得出重排后TCR特异性变化的规律,究竟二次重排后受体特异性的改变有何特征,是有一定方向性的还是完全随机的?抗原受体能否依据环境胁迫因素的不断变化而进行相应的改变?有待进行更深入的研究。　　 鼠T细胞杂交瘤细胞株A1.1是由细胞表面TCR阴性的胸腺瘤细胞BW5147和鼠poly-18特异性T细胞群融合而成,具有T细胞的表面特性,即表达CD3+、CD4+、TCR a/β+,其TCR特异性识别多肽抗原poly-18。本研究发现,A1.1存在罕见的V-V融合现象,提示其可能已经发生二次重排,并具有再次重排的潜力。进而,以A1.1细胞株为T细胞二次重排的研究模型,利用人肝细胞癌相关抗原HCA59对其进行刺激诱导,检测刺激后其重组关键蛋白RAGs和TdT的表达,及TCR的变化,以期发现重排的相关线索与证据,为TCR二次重排的规律及其机制研究奠定基础。　　 方法　　 (1)鼠TCR基因二次重排研究平台的建立　　 ①设计并合成鼠TCR aβ T细胞20个VB家族上游引物和共用的2个CB下游引物,以鼠脾细胞为研究样本,采用半巢式PCR扩增20个TCR Vβ家族的CDR3区,经2％琼脂糖凝胶电泳和TCR基因扫描(GeneScan)技术分析TCR aβ T细胞CDR3多态性；　　 ②设计并合成重组关键蛋白RAGs、TdT的引物,以鼠胸腺细胞为研究对象,提取总RNA,逆转录成cDNA,RT-PCR法进行检测。　　 (2)抗原HCA59诱导.A1.1细胞TCR基因重排的监测　　 ①有限稀释法亚克隆鼠T细胞杂交瘤A1.1,挑选出3株生长良好的细胞亚克隆扩大培养,RT-PCR扩增其20个TCR Vβ家族,结合GeneScan和基因测序技术,分析A1.1细胞TCRβ链CDR3谱型和序列；RT-PCR检测A1.1细胞中重组关键蛋白RAGs、TdT的表达；　　 ②利用抗原HCA59负载的DC冲击A1.1细胞,RT-PCR和荧光定量PCR(qPCR)分别检测抗原诱导后第1-7天A1.1细胞RAGs、TdT mRNA的表达及其动态变化；Western blot检测抗原诱导后RAGs蛋白质水平的表达；　　 ③RT-PCR检测抗原诱导后第1-7天A1.1细胞TCR Vβ家族CDR3谱型及序列变化,qPCR分析连续抗原诱导作用对所表达的TCR Vβ mRNA表达量的影响；流式细胞术检测抗原诱导前后A1.1细胞表面TCR蛋白表达情况。　　 (3)统计学分析　　 所有计量资料用(x)±s表示,不同处理组间、不同时间点细胞TCR Vβ mRNA表达量差异比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),LSD法进行两两比较；RAG、TdT mRNA表达量的差异采用非参数法Kruskal-Wallis H test进行比较,双侧检验,检验水平为a=0.05。所有数据采用SPSS16.0统计软件包进行统计处理。　　 结果　　 (1)鼠TCR基因二次重排研究平台的建立　　 ①2％琼脂糖凝胶电泳结果显示,鼠的脾细胞20TCR VB家族RT-PCR产物在250bp-500bp位置均有清晰条带,GeneScan分析表明,各V8家族CDR3谱型均为8个以上中间高两端低的钟型峰图,呈高斯分布,相邻两峰间距相差3bp;　　 ②RT-PCR结果显示,鼠胸腺细胞可同时检测到RAG1,RAG2,TdTL和TdTS的表达；　　 (2)抗原HCA59诱导A1.1细胞TCR基因重排的监测　　 ①A1.1细胞的三个亚克隆株与母细胞株相同,均稳定表达TCR Vβ1和Vβ10,其中TCR Vβ1家族PCR扩增序列为TCR Vβ1-Jβ2.5-Cβ1；而TCR Vβ10家族同时包含两个V片段,形成融合的Vβ10-Vβ1-Jβ2.5-Cβ1,其蛋白质序列分析表明,这两个融合的V片段不能构成一个完整的编码框；RT-PCR结果显示,A1.1细胞不表达任何重组关键蛋白；　　 ②经抗原HCA59刺激后,A1.1细胞内可检测到RAG1、TdTL和TdTS的表达开放,但未检测到RAG2；qPCR定量分析表明,仅在抗原刺激后3天内检测到RAG1 mRNA,刺激第2天时RAG1的表达量高于其他两天(P<0.001)。与之不同的是,在7天的抗原诱导期间,A1.1细胞内均可检测到TdTmRNA,且。TdTL和TdTS呈相同的变化趋势,随刺激时间的延长,其表达量逐渐增加,在第6天时达到峰值,随后降低；Western blot结果证实了RAG1蛋白质水平的同时表达；　　 ③抗原刺激后的A1.1细胞TCR CDR3谱型和长度、序列分析结果表明,该细胞仍表达TCR Vβ1和融合的Vβ10-Vβ1,且TCR CDR3长度和序列未发生变化；qPCR分析抗原刺激后第1-7天A1.1细胞TCR Vβ1和融合的Vβ10-Vβ1mRNA表达水平,结果表明,其TCR Vβ表达量均随时间呈动态变化,融合的Vβ10-Vβ1 mRNA自刺激第4天起表达量增加,第5天达到峰值；Vβ1mRNA表达量也在第5、6天时增加,刺激第7天时,两个TCR Vβ mRNA表达量均降低；流式细胞仪结果显示,抗原刺激作用未引起TCR分子改变,刺激前后A1.1细胞表面均只表达TCR Vβ1。　　 结论　　 (1)成功建立了鼠TCR二次重排的研究平台,为在鼠细胞模型中开展二次重排的研究奠定基础；　　 (2)A1.1细胞出现罕见的Vβ10-Vβ1融合现象,提示其可能已经发生重排,并具有再次重排的潜力；同时,表明如B细胞一样,T细胞也可发生V-V融合这种特殊的重排方式；　　 (3)代表成熟型T细胞的鼠T细胞杂交瘤A1.1在抗原HCA59的刺激下能够开放表达重组关键蛋白RAG1和TdT,且其TCR mRNA表达水平随时间而变化,虽未检测到新的TCR分子,至少说明该抗原可能诱导A1.1细胞发生了“无效的”TCR二次重排。本研究提示,A1.1细胞具有TCR二次重排的潜力,为进一步研究重排的规律及其机制奠定了实验基础和技术平台。